结核分枝杆菌RelK毒素的Ser/Thr磷酸化通过PknK调控毒素-抗毒素相互作用及功能机制研究

这篇研究揭示了结核分枝杆菌（M. tuberculosis）II型RelK毒素的丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）磷酸化通过激酶PknK调控其与抗毒素RelJ的相互作用，从而影响毒素中和的新机制。研究结合生物信息学预测、分子动力学模拟（MDS）和实验验证，发现Thr77磷酸化导致RelK构象变化，破坏TA复合物稳定性，为细菌持久性（persistence）的调控提供了新视角。

　　

ABSTRACT
结核分枝杆菌的毒素-抗毒素（TA）模块是细菌持久性形成的关键遗传元件。本研究聚焦于RelJK（RelBE3）系统，发现其毒素RelK被丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（STPK）PknK磷酸化后，通过Thr77位点修饰破坏与抗毒素RelJ的结合能力。这一发现揭示了磷酸化作为调控TA功能的新机制。

INTRODUCTION
结核病（TB）的病原体结核分枝杆菌通过持久性表型逃逸宿主免疫和抗生素压力。TA系统（如RelBE、VapBC等）在应激响应中起核心作用，但其调控机制尚不明确。研究团队通过生物信息学分析发现，85%的M. tuberculosis TA蛋白含潜在磷酸化位点，提示STPK可能通过翻译后修饰（PTM）调控TA功能。

RESULTS

In silico预测TA模块的翻译后修饰
利用MusiteDeep和NetPhosBac工具分析128个TA蛋白，显示Ser/Thr磷酸化占比最高（图1）。Rel家族毒素（RelE/RelK）和抗毒素（RelJ）均含多个预测位点，其中RelK的Thr77在进化中高度保守。

PknK与Rel TA蛋白的互作
通过分枝杆菌蛋白片段互补（M-PFC）实验证实，PknK与RelE毒素、RelK毒素及RelJ抗毒素在体内结合（图2A-B）。体外激酶实验进一步验证PknK对RelJ（Thr21/Ser55/Ser74）和RelK（Thr77）的特异性磷酸化（图2C-D），磷酸化信号强度增加3倍以上。

RelJK磷酸化位点的质谱鉴定
LC-MS/MS鉴定出RelK的唯一磷酸化位点Thr77（图4A），而RelJ含三个位点（图4B）。这一结果与生物信息学预测高度吻合，为后续功能研究奠定基础。

Thr77磷酸化引发RelK结构重编程
分子动力学模拟（250 ns）显示，Thr77磷酸化（RelK~P）导致RelK的β-折叠和α-螺旋减少（图5C-D），静电势从-5 kT/e（红色）减弱至-3 kT/e（黄色）（图5E-F）。残基相互作用网络分析表明，磷酸化破坏Gly33与Ile32/Lys80等关键相互作用（图5G-H），提示构象不稳定性增加。

磷酸化干扰TA复合物形成
天然电泳和等温滴定量热法（ITC）证实，RelK~P完全丧失与RelJ的结合能力（图6D-F）。MDS显示RelJK~P复合物的氢键数量从18个降至11个（图6C），结合自由能升高2.1 kcal/mol，表明磷酸化直接削弱TA相互作用。

Thr77突变体的表型验证
在E. coli和M. smegmatis中，RelK_Mut
T77A（磷酸缺陷）和T77E（磷酸模拟）突变体均表现出与RelJ结合减弱，导致毒素中和效率降低（图7B-C）。尤其值得注意的是，T77E突变体在分枝杆菌中24小时的存活率显著低于野生型（P<0.05），证实Thr77是TA互作界面的关键残基。

DISCUSSION
本研究首次提出STPK通过磷酸化毒素（而非传统认知的抗毒素）来调控TA模块的功能。PknK在氮饥饿条件下上调，与RelJK协同响应环境压力。Thr77磷酸化引发的构象变化类似于“变构开关”，通过破坏TA界面促进游离毒素积累，可能促进持久性形成。这一发现为靶向TA系统的抗结核策略提供了新思路——例如设计模拟Thr77磷酸化的小分子以干扰TA稳态。

MATERIALS AND METHODS
研究采用多学科方法：

1. 蛋白互作：M-PFC实验在M. smegmatis中完成；
2. 磷酸化检测：ProQ Diamond染色结合LC-MS/MS；
3. 结构分析：GROMACS模拟（CHARMM36力场）结合APBS静电势计算；
4. 功能验证：E. coli双质粒系统（pLTA/pCAK）和M. smegmatis基因组整合株（pJFR19载体）。

创新点
突破传统TA调控范式，揭示“毒素磷酸化”这一全新机制；
整合计算生物学（如MusiteDeep预测）与湿实验（ITC/MDS），为细菌信号转导研究提供范式。