靶向pH响应性纳米颗粒在巨噬细胞富集的3D免疫球体模型中诱导IL-12的免疫刺激作用研究

这篇研究开发了一种pH响应性纳米颗粒（NPs）递送系统，通过封装白细胞介素12（IL-12）靶向肿瘤微环境（TME）的弱酸性（pH~6.5）特性，有效激活巨噬细胞向促炎M1表型极化。研究结合新型结直肠癌（CRC）3D免疫球体模型，验证了NPs通过增加干扰素γ（IFN-γ）和一氧化氮（NO）释放、降低抗炎标志物CD163和IL-10表达，重塑免疫抑制性TME的潜力，为CRC免疫治疗提供了创新策略。

　　

摘要

转移性结直肠癌（CRC）的5年生存率仅为14%，免疫疗法未能显著改善预后。肿瘤微环境（TME）的弱酸性（pH~6.5）和免疫抑制特性是治疗失败的关键因素。白细胞介素12（IL-12）作为强效促炎细胞因子，可通过诱导干扰素γ（IFN-γ）逆转免疫抑制，但其全身毒性限制了临床应用。本研究开发了封装IL-12的pH响应性聚合物纳米颗粒（NPs），利用2,3-二甲基马来酸酐（DMMA）修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）在酸性TME中触发电荷反转和药物释放。体外实验表明，IL-12 pH响应性NPs在pH 6.5条件下显著增强巨噬细胞的M1极化，表现为IFN-γ分泌增加和CD86⁺
标志物上调，同时抑制M2表型标记物CD163⁺
和IL-10分泌。

方法

通过酰胺化反应合成PLGA-DMMA共聚物，经核磁共振（¹
H NMR）验证后，采用双乳液法制备IL-12负载NPs。NPs的粒径约200-250 nm，多分散指数（PDI）为0.1，在pH 6.5时表面电荷由中性转为正电，24小时内释放70% IL-12（pH 7.4仅45%）。采用RAW 264.7巨噬细胞和人原代单核细胞衍生的巨噬细胞评估NPs的生物相容性和免疫调节功能，并通过新型CRC 3D免疫球体模型（含SW48肿瘤细胞、胶原基质和巨噬细胞）模拟TME复杂性。

结果与讨论

pH响应性NPs的合成与表征
PLGA-DMMA的¹
H NMR谱显示δ=2.54 ppm处特征峰，证实DMMA成功接枝。NPs在pH 6.5时粒径减小且ζ电位升高，表明酸性触发DMMA水解。体外释放实验显示pH 6.5下IL-12释放更快，符合TME靶向需求。

巨噬细胞重编程效应
IL-12 pH响应性NPs在2D模型中使巨噬细胞代谢活性保持>70%（ISO 10993-5标准），同时诱导NO释放量提高2-3倍，IFN-γ分泌显著增加（500 pg/mL时达峰值）。3D免疫球体中，NPs将CD14⁺
CD86⁺
M1样细胞比例提升至对照组的1.8倍，并降低CD14⁺
CD163⁺
M2样细胞占比。

3D模型验证
胶原增强的65:35（巨噬细胞:SW48细胞）球体展现出稳定代谢活性和直径（~650 μm）。免疫荧光显示巨噬细胞均匀分布于肿瘤细胞间，且NPs处理组IFN-γ水平较非响应性NPs提高1.5倍，IL-10降低40%。

结论

该研究创新性地结合pH响应性NPs与仿生3D模型，证实了IL-12靶向递送系统通过调控巨噬细胞极化改善CRC免疫微环境的潜力。未来需优化NPs在生理pH下的稳定性，并探索其与现有免疫疗法的协同作用。