蝙蝠源Merbecovirus EjCoV-3的ACE2/DPP4非依赖性细胞入侵机制及跨物种传播潜力研究

本研究首次揭示日本蝙蝠源Merbecovirus EjCoV-3通过非ACE2/DPP4受体入侵细胞的分子机制，利用细菌人工染色体（BAC）反向遗传学成功拯救病毒，证实其在人呼吸道/肠道细胞及仓鼠鼻腔纤毛上皮的高效复制能力，为评估蝙蝠冠状病毒（CoV）跨物种传播风险提供了关键实验依据。

　　

ABSTRACT

Betacoronavirus（β冠状病毒）在过去二十年引发三次人类疫情，其自然宿主蝙蝠持续携带潜在人畜共患病病毒。研究团队针对日本蝙蝠（Eptesicus japonensis）分离的Merbecovirus亚属EjCoV-3毒株展开系统研究，发现其刺突蛋白（S蛋白）依赖蛋白酶激活但无需经典受体ACE2或DPP4即可介导细胞入侵。通过建立基于细菌人工染色体（BAC）的反向遗传学系统，成功获得具有复制能力的重组病毒，证实其在人呼吸道细胞（RPMI2650）、肠道细胞（HRT18G/CaCo-2）及仓鼠鼻腔上皮的高效复制能力，提示存在未知受体介导的跨物种传播风险。

INTRODUCTION

冠状病毒分为α、β、γ和δ四个属，其中β属包含SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2等高致病性病毒。Merbecovirus亚属的代表株MERS-CoV以DPP4为受体，而近年发现的非洲蝙蝠源NeoCoV等则利用ACE2入侵。日本蝙蝠EjCoV-3的S蛋白与已知受体结合特性迥异，其基因组分析显示仅保留1个DPP4接触残基，但具有11个与HKU5-19s相似的ACE2接触位点。研究通过假病毒和真病毒系统，系统解析其入侵机制与宿主范围。

RESULTS

蛋白酶处理增强假病毒入侵

VSV/EjCoV-3假病毒实验显示，高浓度胰蛋白酶（500 μg/mL）或嗜热菌蛋白酶（100 μg/mL）处理使感染效率提升10倍以上。Western blot揭示两种蛋白酶产生差异切割模式：胰蛋白酶生成17/43 kDa片段，嗜热菌蛋白酶产生65 kDa片段。N端测序定位嗜热菌蛋白酶切割位点于S1/S2连接区上游，该区域缺乏典型弗林蛋白酶切割位点（仅含单个精氨酸残基）。

TMPRSS2与组织蛋白酶协同作用

在过表达人TMPRSS2的Vero细胞中，胰蛋白酶处理的VSV/EjCoV-3感染性显著增强，而嗜热菌蛋白酶处理组无此效应。组织蛋白酶B/L抑制剂E-64d可阻断胰蛋白酶处理组的入侵，暗示内吞体途径参与。病毒附着后添加蛋白酶使感染效率提升3倍，表明受体结合可能暴露S蛋白的蛋白酶切割位点。

非经典受体利用特征

CRISPR敲除DPP4或ACE2的Vero细胞中，VSV/EjCoV-3感染性未受影响，而对照病毒VSV/MERS-CoV和VSV/SARS-CoV则严格依赖相应受体。受体回补实验进一步验证EjCoV-3采用独立于ACE2/DPP4的未知入侵途径。

反向遗传学系统构建

将全长EjCoV-3基因组克隆至BAC载体，转染HEK293T细胞后获得P0代病毒。经嗜热菌蛋白酶激活后接种Vero/TMPRSS2细胞，配合胰蛋白酶（10 μg/mL）培养，成功获得滴度达5.4×10⁵
PFU/mL的重组病毒。全基因组测序确认无变异，电镜观察到典型冠状病毒颗粒（直径80-120 nm）。

人类细胞感染特征

重组EjCoV-3在人鼻咽癌（RPMI2650）、结肠癌（CaCo-2）和直肠癌（HRT18G）细胞中均实现高效复制，最高滴度达10⁷
PFU/mL。蛋白酶浓度梯度实验显示，10 μg/mL胰蛋白酶或5 μg/mL嗜热菌蛋白酶可使病毒产量提升100倍。TMPRSS2过表达使病毒在低蛋白酶条件下复制能力增强，提示宿主蛋白酶与外加蛋白酶存在协同效应。

仓鼠模型感染表现

鼻内接种EjCoV-3的叙利亚仓鼠虽无体重下降，但病毒在鼻甲中复制达10⁴
PFU/g组织，免疫组化显示纤毛上皮细胞存在病毒抗原，伴淋巴细胞浸润。肠道组织未检测到病毒复制，与蝙蝠粪便排毒特征形成有趣对比。

DISCUSSION

本研究首次证实蝙蝠Merbecovirus可通过非ACE2/DPP4途径感染哺乳动物呼吸道。EjCoV-3的S蛋白具有独特特征：①缺乏弗林蛋白酶切割位点，依赖外源蛋白酶激活；②保守的唾液酸结合位点可能辅助宿主细胞附着；③仓鼠鼻腔特异性复制提示局部蛋白酶可能替代体外添加的蛋白酶。这些发现拓展了对冠状病毒受体多样性的认知，强调除ACE2/DPP4外，唾液酸糖缀合物等分子可能参与蝙蝠病毒跨物种传播。建立的BAC反向遗传学平台为未来Merbecovirus功能研究提供关键技术支撑。

MATERIALS AND METHODS

关键技术包括：①VSV假病毒包装系统；②CRISPR/Cas9介导的Vero细胞受体基因敲除；③SW102细菌同源重组构建BAC-EjCoV-3；④仓鼠鼻腔灌注接种模型。病毒滴定采用噬斑法（琼脂糖覆盖含2.5 μg/mL嗜热菌蛋白酶），免疫组化使用抗N蛋白单抗（5F3克隆）。统计学分析采用Holm法多重比较检验。