大肠杆菌O157:H7中噬菌体对脂多糖的多位点结合及噬菌体抗性的适应性代价研究

本文揭示了T4样噬菌体PSD2001和PNJ212对大肠杆菌O157:H7 EDL933株的差异化受体识别机制：PSD2001通过O抗原荚膜（CPS）和脂多糖（LPS）的多位点结合（Glc II/III/Gal I）实现吸附，其尾丝蛋白ORF165为受体结合蛋白（RBP）；而PNJ212以外膜蛋白OmpC为受体，RBP为gp37样蛋白ORF108。研究首次阐明R3型LPS的噬菌体结合位点，并发现噬菌体抗性菌株在抗生素敏感性、生物膜形成及环境适应力等方面存在显著适应性代价，为优化噬菌体鸡尾酒疗法和"噬菌体轮换"策略提供理论依据。

　　

噬菌体与宿主的"锁钥博弈"：大肠杆菌O157:H7的攻防战

【ABSTRACT】
作为重要的食源性病原体，大肠杆菌O157:H7因其产志贺毒素的特性引发全球食品安全关注。面对抗生素耐药性挑战，噬菌体疗法展现出精准生物治疗的潜力。本研究聚焦两株T4样噬菌体PSD2001与PNJ212，揭示其差异化识别宿主表面受体的分子机制，并系统评估细菌获得噬菌体抗性后付出的适应性代价。

【INTRODUCTION】
自1982年在美国暴发事件中首次分离以来，O157:H7血清型已成为公共卫生重大威胁。传统抗生素治疗因耐药性加剧而受限，噬菌体疗法凭借宿主特异性成为替代选择。但细菌通过改变吸附受体（如LPS、CPS、OmpC）等机制逃逸噬菌体感染，这种"军备竞赛"促使研究者探索噬菌体-宿主互作的本质规律。

【RESULTS】

噬菌体PSD2001的双受体识别策略
通过筛选50株自然突变抗性菌，发现^waaF
（LPS合成基因）和^etp
（O抗原荚膜形成基因）突变介导抗性。电镜与吸附实验证实：

1. CPS作为主要受体：Δ^etp
   突变株丧失荚膜结构，吸附效率降低80%
2. LPS作为次要受体：Δ^waaF
   突变株吸附效率下降60%，竞争实验显示外核心多糖Glc II/III和Gal I为关键结合位点
3. 尾丝蛋白ORF165的C端结构域（与T4噬菌体gp37同源66.66%）被鉴定为LPS结合蛋白

噬菌体PNJ212的差异化识别
全基因组测序揭示Δ^ompC
突变株对PNJ212完全抗性。荧光标记实验证实：

1. OmpC为唯一受体：Δ^ompC
   的吸附率仅为野生型的20%
2. 尾丝蛋白ORF108（与T4 gp37同源62.45%）通过C端结构域特异性结合OmpC

抗性菌的适应性代价

1. 膜通透性改变：Δ^waaF
   株内外膜通透性显著增加，对红霉素等亲脂抗生素敏感性提升4-8倍
2. 环境适应力下降：Δ^waaF
   在模拟胃肠液中的存活率降低50%，但Δ^{ompC
   在血清中存活率反升30%}
3. 生物膜双刃剑：LPS缺陷株（Δ^waaF
   ）生物膜形成增强2倍，而Δ^etp
   无显著变化
4. 定植能力减弱：突变株在小鼠结肠的细菌载量较野生型降低1-2个数量级

【DISCUSSION】
研究首次描绘T4样噬菌体对O157:H7的多层次识别网络：PSD2001采用"双受体-多位点"模式，而基因组同源性达96.59%的PNJ212却演化出完全不同的OmpC靶向机制。gp37样蛋白的结构变异（ORF165与ORF108仅14.58%同源）解释了受体特异性差异。

细菌抗性代价呈现"三重缺陷"：

1. LPS截短导致膜完整性破坏，增强抗生素渗透
2. CPS缺失促进O抗原暴露， paradoxically提升血清抗性
3. OmpC缺失通过补偿性表达维持抗生素抗性，但削弱环境适应

这些发现为临床噬菌体疗法提供新思路：针对多重受体的"噬菌体鸡尾酒"可延缓抗性产生，而利用抗性菌的适应性缺陷（如LPS突变株的抗生素超敏）可设计联合治疗方案。

【MATERIALS AND METHODS】
实验体系涵盖：

1. 基因编辑：λ-Red同源重组构建^waaF
   /^etp
   /^ompC
   缺失株
2. 功能验证：吸附抑制实验、荧光竞争结合、透射电镜观察
3. 表型分析：微量肉汤稀释法测MIC、PI/NPN膜通透性检测、H&E结肠病理评分

该研究通过多组学方法解析噬菌体疗法的关键分子机制，为应对"后抗生素时代"挑战提供创新解决方案。