副溶血弧菌T3SS2基因表达的宿主细胞接触依赖性调控机制：VtrN负反馈调节的分子机制与感染策略

（编辑推荐）本研究揭示了副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）通过III型分泌系统2（T3SS2）感知宿主细胞内高K+ 信号，分泌新型负调控因子VtrN抑制毒力岛（Vp-PAI）基因表达的分子机制。VtrN直接结合转录主调控因子VtrB，在游离状态下抑制毒力基因表达，而宿主接触后通过T3SS2分泌VtrN解除抑制，实现感染过程中的精准时空调控。这一发现为革兰阴性菌T3SS的宿主适应策略提供了新见解。

　　

ABSTRACT

副溶血弧菌作为食源性胃肠炎的主要病原体，其III型分泌系统2（T3SS2）是介导宿主细胞损伤的关键毒力因子。研究发现，Vp-PAI编码的T3SS2能通过感知宿主细胞内高K⁺
浓度触发分泌底物转换，而这一过程受门控蛋白（gatekeeper）VgpA/VgpB调控。门控蛋白缺失突变体表现出效应蛋白异常分泌和Vp-PAI基因表达上调，提示存在T3SS2分泌依赖性负调控机制。

RESULTS

门控基因缺失导致Vp-PAI基因上调
RNA-seq分析显示，vgpA/vgpB双缺失突变体中48个Vp-PAI基因表达显著升高（>4倍），且该效应依赖T3SS2分泌活性。在分泌缺陷型菌株POR-2ΔvcrD2中，门控突变不再引起基因表达变化，暗示分泌系统可能输出某种抑制因子。

新型T3SS2分泌蛋白VtrN的鉴定
通过比较蛋白质组学，研究者从17个候选蛋白中锁定VPA1369（后命名VtrN）。Δvpa1369突变体对Caco-2细胞的细胞毒性显著增强，VopT效应蛋白转运效率提升2倍。免疫印迹证实VtrN的分泌具有T3SS2依赖性和K⁺
响应性——在模拟宿主接触的KCl条件下分泌量增加，而NaCl条件下则检测不到。CyaA报告系统进一步证明VtrN能被直接注入宿主细胞。

VtrN的负调控机制
转录组分析显示，ΔvtrN菌株中51个Vp-PAI基因表达上调，包括转录调控级联中的vtrA/vtrB/vtrC。值得注意的是，这种调控不依赖T3SS2分泌活性，表明VtrN在胞内直接发挥作用。酵母双杂交和体外pull-down实验揭示，VtrN通过结合VtrB的柔性连接区（S158截断体）抑制其转录活性。当细菌感知宿主K⁺
信号后，VtrN被T3SS2分泌至胞外，解除对VtrB的抑制，从而激活毒力基因表达。

DISCUSSION

该研究首次阐明副溶血弧菌通过"分泌型转录抑制因子"实现环境适应的独特策略：在游离状态下，VtrN-VtrB复合物维持低水平毒力表达；宿主接触后，K⁺
感应触发VtrN分泌，形成正反馈循环强化感染。与铜绿假单胞菌Exs系统不同，VtrN将分泌调控与转录抑制直接耦合，体现了T3SS调控网络的进化多样性。这一发现为开发针对细菌接触依赖性毒力激活的干预策略提供了新靶点。

MATERIALS AND METHODS

研究采用等位基因替换构建突变体，通过RNA-seq和qRT-PCR分析基因表达，LC-MS/MS鉴定分泌蛋白，酵母双杂交和GST pull-down验证蛋白互作。细胞毒性通过LDH释放实验评估，效应蛋白转运采用CyaA报告系统检测。所有实验均设置三重生物学重复，统计学分析采用Shapiro-Wilk正态检验配合t检验或Mann-Whitney检验。