基于卷曲螺旋结构的预靶向药物递送系统在乳腺癌精准治疗中的应用研究

本研究针对抗体药物偶联物(ADCs)存在的组织穿透性差、肿瘤蓄积低及"脱靶"毒性等问题，开发了基于Zip1/Zip2卷曲螺旋蛋白特异性相互作用的预靶向给药系统。通过将单链抗体(scFv)与Zip2融合作为靶向载体，Zip1-SNAP偶联细胞毒素MMAE作为效应载体，实现了乳腺癌细胞的精准杀伤，为ADC设计提供了新策略。

　　

在肿瘤治疗领域，抗体药物偶联物(ADCs)被誉为"魔法子弹"，它通过抗体精准识别肿瘤抗原，携带强效细胞毒素定向杀伤癌细胞。然而现实中的ADCs却面临三大困境：大分子抗体穿透肿瘤组织能力有限，血液循环时间长导致"脱靶"毒性，以及复杂的生产工艺导致产品异质性。特别是在乳腺癌治疗中，针对Her2和Trop2的ADCs虽已获批，但对三阴性乳腺癌等难治亚型仍显不足。

针对这些挑战，国外研究团队在《European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics》发表创新研究。他们从自然界广泛存在的卷曲螺旋结构获得灵感，设计出两阶段给药的预靶向系统：第一阶段注射靶向载体——融合Zip2的scFv抗体片段，第二阶段注射效应载体——Zip1-SNAP偶联的细胞毒素MMAE。这种"分步式"策略既保留了抗体靶向性，又通过小分子效应载体改善组织穿透性。

研究采用HEK293T哺乳动物表达系统生产重组蛋白，通过Ni-NTA亲和层析纯化。运用SNAP-tag技术实现MMAE与Zip1的特异性偶联，采用流式细胞术和荧光显微镜验证靶向复合物的结合与内化能力。体外实验选用7种乳腺癌细胞系（包括TNBC、ER⁺
和Her2⁺
亚型），通过XTT法和Annexin V/PI凋亡实验评估细胞毒性。采用组织芯片技术分析100例乳腺癌样本中EGFR/Her2/Trop2表达谱。

【3.1 蛋白富集】成功表达并纯化scFv-Zip2和Zip1-SNAP融合蛋白，产量达5-10 mg/L，SDS-PAGE和荧光标记证实蛋白完整性和功能活性。

【3.2 Zip对特异性互作】Far-western blot证实Zip1仅与Zip2融合蛋白结合，不与scFv-SNAP反应。SNAP-tag实现MMAE高效定点偶联，2小时完成反应且无残留活性位点。

【3.3 预靶向复合物特异性结合】流式显示预靶向复合物在EGFR^high
（MDA-MB-468）、Her2^high
（SKBR3）和Trop2^high
（MDA-MB-231）细胞中结合强度与抗原表达量正相关，而Zip1-647单独处理组几乎无结合。

【3.4 复合物内化过程】共聚焦显微镜观察到scFv-Sacit-Zip2-488与Zip1-647在Trop2⁺
细胞膜共定位，3小时内完成内化，荧光强度曲线显示双信号峰值重叠。

【3.5 组织靶向性验证】多色免疫荧光显示EGFR和Trop2在乳腺癌组织表达率约40%，Her2约20%。scFv-Sacit-SNAP在组织芯片中的结合模式与Trop2抗体高度一致。

【3.6 特异性细胞毒性】预靶向系统在抗原阳性细胞中展现纳摩尔级杀伤：scFv-Herceptin-Zip2-Zip1-MMAE对SKBR3的IC₅₀
为133 nM，而三抗体联用可使SKBR3（三抗原阳性）IC₅₀
降至85.31 nM。

【3.7 凋亡诱导机制】Annexin V/PI双染证实MMAE通过触发凋亡发挥杀伤作用，预靶向组凋亡率与直接偶联ADC无统计学差异（p>0.05）。

这项研究开创性地将卷曲螺旋结构应用于ADC设计，其核心价值体现在三个方面：首先，模块化设计使靶向单元（scFv-Zip2）与效应单元（Zip1-MMAE）可自由组合，避免重复偶联步骤；其次，小分子效应载体（32 kDa）较传统IgG（150 kDa）显著改善肿瘤穿透性；最后，SNAP-tag技术确保产物均一性，克服传统ADC批次差异问题。

虽然预靶向系统在体外显示略低的杀伤效力（IC₅₀
提高1.5-2.6倍），但这是为换取更好安全性做出的合理权衡。作者团队指出，未来可优化人源化卷曲螺旋对（如FOS/JUN）降低免疫原性，并通过体内实验验证药代动力学特性。该技术平台不仅适用于乳腺癌，理论上可拓展至任何存在明确肿瘤抗原的癌症治疗，为ADC发展开辟了新航道。