基于ARTP诱变与发酵优化的Actinoplanes deccanensis菌株提升非达霉素产量研究

为解决非达霉素(Fidaxomicin)工业化生产中发酵产量低、副产物多的问题，研究人员通过ARTP诱变技术结合kanR/gusA双报告系统筛选高产菌株PA-13，并通过甲基转移酶过表达和外源DMSO添加将产量提升至929.17 mg/L，最终在15 L发酵罐中实现3.95 g/L的创纪录产量，为抗艰难梭菌感染(CDI)药物的规模化生产奠定基础。

　　

艰难梭菌感染(Clostridioides difficile infection, CDI)是医院获得性腹泻的主要病因，而大环内酯类抗生素非达霉素(Fidaxomicin)因其较万古霉素和甲硝唑更低的复发率成为临床优选。然而，该药物工业化生产面临两大瓶颈：原始菌株Actinoplanes deccanensis的发酵效价不足2 g/L，且生物合成过程中甲基化不完全导致副产物占比高达62.3%。这些限制严重制约了药品的可及性。

为解决这一难题，中国研究人员在《Synthetic and Systems Biotechnology》发表的研究中，采用大气室温等离子体(ARTP)诱变技术结合创新性的筛选策略，成功将非达霉素产量提升至工业化可行水平。研究团队以过表达正调控因子fadR1的OE-R1/WT菌株为出发菌株，构建了基于A1p启动子的kanR/gusA双报告系统，通过抗性梯度筛选和β-葡萄糖醛酸酶(GusA)显色反应实现高通量筛选。关键实验技术包括：ARTP突变库构建（120 W功率/200 s处理）、双报告系统筛选、甲基转移酶fadS2/fadS5的串联过表达、外源二甲基亚砜(DMSO)添加策略，以及15 L发酵罐的工艺放大优化。

3.1 双报告系统构建
研究团队选择聚酮合酶基因fadA1的启动子A1p驱动kanR和gusA基因表达。工程菌R1-pLRM02的卡那霉素抗性提升至60 mg/L（野生型仅30 mg/L），且X-Gluc显色反应呈现显著蓝色，为突变体筛选建立可视化标准。

3.2 ARTP诱变高产菌株筛选
在88%致死率的ARTP处理条件下，通过双报告系统从125个克隆中高效筛选出36个阳性突变体，其中PA-13菌株产量达757.34 mg/L，较出发菌株提高5.5倍。qRT-PCR证实该菌株中fadA1-A4等生物合成基因簇转录水平全面上调。

3.3 代谢途径优化
LC/MS分析发现主要副产物分子量较非达霉素少14 Da（缺失1个甲基）。过表达甲基转移酶FadS2（C-甲基化）和FadS5（O-甲基化）使副产物占比从62.3%降至30.6%，产量同步提升至825.14 mg/L。添加0.6% DMSO后，产量进一步增至929.17 mg/L，副产物降至20.9%，推测DMSO通过增强膜通透性缓解反馈抑制。

3.5 发酵工艺优化
摇瓶水平优化显示ISP2培养基、pH 9.0、48 h种龄和8 mm玻璃珠为最佳条件，产量达1122.97 mg/L。在15 L发酵罐中，通过将培养基INM2替换为含蔗糖/山梨醇的FEM-2配方，溶解氧(DO)稳定在30-40%，最终在216小时获得3949.05 mg/L的产量，创下该菌株的发酵纪录。

这项研究首次实现Actinoplanes deccanensis在15 L规模的非达霉素高产，其创新性体现在三方面：1）双报告系统将筛选效率从33.3%提升至77.8%；2）甲基化修饰调控策略显著降低副产物；3）DMSO添加揭示了膜转运调控的新机制。尽管研究未阐明ARTP突变的具体位点，但全基因簇转录上调现象为后续代谢工程提供了方向。未来通过连续发酵工艺和酶定向进化，有望进一步突破5 g/L的产业门槛。该成果不仅为CDI治疗药物提供了稳定供给方案，其"诱变-筛选-通路优化-工艺放大"的四步策略也为其他放线菌次级代谢产物生产提供了范式。