大肠杆菌代谢工程改造实现角鲨烯高效生物合成：基于氧化还原平衡与膜脂重塑的系统优化策略

本研究针对微生物宿主中角鲨烯生物合成途径效率低下和储存能力受限的瓶颈问题，通过系统代谢工程策略整合氧化还原平衡的HMGR变体和膜脂重塑技术。研究人员开发了NADPH依赖型和NADH偏好型HMGR的杂合系统，使角鲨烯产量达852.06±28.95 mg/L；通过过表达dgs、murG和plsC基因构建脂质富集的伸长型细胞，产量提升至970.86±55.67 mg/L；最终在3 L生物反应器中采用延迟诱导策略结合十二烷覆盖系统，实现1267.01 mg/L的角鲨烯滴度。该研究揭示了脂肪酸(FA)和磷脂酰乙醇胺(PE)作为角鲨烯关键储存库的机制，为原核宿主疏水性代谢物生产提供了普适性框架。

　　

角鲨烯作为一种具有抗癌、抗氧化和免疫刺激作用的多不饱和三萜化合物，在医药和保健品领域需求激增，全球市场规模预计2030年将达2.31亿美元。然而传统从鲨鱼肝脏和植物油脂提取的方式面临资源限制和生态可持续性问题，微生物合成成为重要替代方案。尽管酵母平台已实现50 g/L以上的高产，但大肠杆菌(Escherichia coli)作为具有生长快速、遗传操作简便等优势的微生物底盘，其角鲨烯产量长期低于克级水平，主要受限于前体供应不足、氧化还原失衡以及疏水性产物储存能力有限等瓶颈。

针对这些挑战，中国科学院等机构的研究人员Jiangming Zhu等人在《Synthetic and Systems Biotechnology》发表研究，通过整合途径工程和细胞物流优化的创新策略，系统解决了角鲨烯生物合成的关键限制因素。研究首先筛选获得截短型人源角鲨烯合酶(hSQS)，并通过引入古菌来源的NADH偏好型3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(AfHMGR)，使产量提升至439.85±14.69 mg/L。进一步改造磷酸戊糖途径(PPP)和糖异生途径关键基因(zwf、tktA、fbaB等)，并引入NADPH依赖型的拟南芥源甘油醛-3-磷酸脱氢酶(AtGapA)，使角鲨烯产量达到852.06±28.95 mg/L。在储存工程方面，过表达膜形态相关基因dgs和murG使细胞伸长并增加膜表面积，同时过写脂质代谢基因plsC和clsC显著提升磷脂酰乙醇胺(PE)含量，最终通过多基因组合优化使产量提升至970.86±55.67 mg/L。在3 L生物反应器中采用延迟诱导和十二烷覆盖的in situ回收策略，实现1267.01 mg/L的最高产量。

关键技术方法包括：(1) CRISPR基因编辑构建基因组整合菌株；(2) 激光共聚焦显微镜观察尼罗红染色细胞形态；(3) 绝对定量脂质组学分析；(4) 高效液相色谱(HPLC)检测角鲨烯含量；(5) 分批补料发酵工艺优化。

3.1部分显示，通过比较不同来源的角鲨烯合酶(SQS)，人源hSQS表现出最优活性(7.43±0.12 mg/L)，其N端截短变体使产量再提升62.7%。在甲羟戊酸(MVA)途径优化中，古菌源AfHMGR因其在碱性条件下的高活性和NADH偏好特性，使产量较初始提升269倍。基因组整合与质粒表达的协同策略证明，同时利用NADPH依赖型(SaHMGR)和NADH偏好型(AfHMGR)的氧化还原互补效果最佳。

3.2部分揭示了前体供应策略：通过改造PPP途径(zwf、tktA)和糖异生途径(fbaB、fbp)增强NADPH供应，结合AtGapA替换内源gapA，使NADPH生成效率提升12.3%。引入ATP非依赖型甘油利用途径(glpF-gldA-dhaKLM)进一步优化碳源利用，这些系统改造使产量突破850 mg/L大关。

3.3部分的创新发现在于：过表达糖基转移酶dgs使细胞长度增加2.3倍，同时使脂肪酸(FA)含量提升38.7%；而过写磷脂酰乙醇胺合成相关基因(plsC、murG)则使PE含量增加37.6%。抑制剂实验证实，抑制FA合成的角鲨烯产量降幅(41.3%)大于抑制PE合成(23.5%)，但两者均为关键储存载体。脂质组学显示工程菌株总脂质增加21.8%，其中PE(17:0/18:1)和FA(16:0)是最显著变化的分子种类。

3.4部分的发酵优化表明，高密度培养(OD₆₀₀
=60)时延迟诱导配合10%十二烷覆盖，可缓解产物抑制，但后期仍出现产量下降，提示需要进一步优化产物转运机制。

该研究的重要意义在于：首次系统阐明了大肠杆菌中角鲨烯的储存机制，证实FA和PE作为主要储存载体；创建了氧化还原平衡的杂合HMGR系统；开发出通过膜形态工程增强疏水性化合物积累的普适性策略。这些发现不仅将大肠杆菌角鲨烯产量提升至报道最高水平，更为原核宿主生产其他疏水性代谢物(如类胡萝卜素、多烯烃等)提供了可借鉴的工程范式。未来通过整合转运蛋白工程和动态途径调控，有望进一步突破产量瓶颈，推动微生物合成角鲨烯的工业化应用。