酿酒酵母AS2.346中NADPH依赖性羰基还原酶的鉴定、表征及应用——提升(13R,17S)-乙基二醇产量的关键酶发现与改造

为解决左炔诺孕酮合成中关键中间体(13R,17S)-乙基二醇生物转化效率低的问题，中国科学院上海有机化学研究所团队鉴定了酿酒酵母AS2.346中新型NADPH依赖性羰基还原酶AsSDR1。通过基因编辑、亚细胞定位分析和蛋白质工程，发现AsSDR1的线粒体外定位是其高效催化活性的关键，突变体I180A使产量提升47.88%，联合NADPH代谢改造后产量增幅达111.25%，为甾体药物绿色制造提供新策略。

　　

【研究背景】
在避孕药领域，左炔诺孕酮作为全球使用最广泛的口服避孕药，其合成效率直接影响公共卫生需求。传统化学合成路线存在步骤冗长、环境污染严重等问题，而生物催化因其绿色高效特性成为替代方案。其中，酿酒酵母AS2.346自1976年起被用于催化关键中间体乙基二酮转化为(13R,17S)-乙基二醇，但半个世纪以来其关键酶机制始终未明。随着合成生物学发展，解析这一"黑箱"过程并提升转化效率，成为突破甾体药物生产瓶颈的关键。

【研究机构与方法】
中国科学院上海有机化学研究所团队通过基因组挖掘技术，从酿酒酵母AS2.346中鉴定出两个短链脱氢酶/还原酶(SDR)基因Assdr
1和Assdr
2。采用CRISPR-Cas9基因编辑构建敲除株，结合荧光标记亚细胞定位技术揭示酶分布特征；通过分子对接和100 ns分子动力学模拟解析催化机制；利用代谢组学分析基因功能；最后通过启动子工程和NAD激酶pos
5Δ17截短体过表达实现代谢通量优化。

【研究结果】

3.1 关键酶的发现与验证
通过同源比对发现AsSDR1与KRED1-Pglu相似度达45.2%。重组大肠杆菌实验证实AsSDR1催化效率(152.40 U/g)显著高于AsSDR2(100.39 U/g)，且仅Assdr
1敲除株HCY100的产物产量骤降89.4%，证明其主导作用。

3.4 亚细胞定位的奥秘
EGFP标记实验显示AsSDR2与线粒体共定位(Pearson系数0.605)，而AsSDR1分布于胞质(Pearson系数0.298)。这种差异解释了为何体外活性相近的两种酶在体内表现迥异。

3.6 意外的代谢调控功能
代谢组学发现Assdr
1敲除株HCY100中2,3-丁二醇、γ-氨基丁酸等风味物质异常，序列比对提示AsSDR1可能具有蝶呤还原酶功能，参与芳香族氨基酸代谢调控。

3.9 蛋白质工程的精妙设计
分子动力学模拟发现Leu89、Ile180、Ile189构成底物通道"三重门"。单点突变I180A使攻击距离缩短至3.48 ?，氢键数量增加，最终使突变体HCE012转化率提升至98.26%。

3.12 代谢工程的协同效应
过表达截短型NAD激酶pos
5Δ17使NADPH再生速率提升1.68倍，联合Assdr
1-I180A使最终产量较野生型提高111.25%，时空产率达9.04 mg/(L·h)。

【结论与意义】
该研究首次阐明酿酒酵母AS2.346中(13R,17S)-乙基二醇合成的分子机制，发现亚细胞定位差异是SDR家族功能分化的关键因素。通过"酶定位-结构-代谢"多维度改造，建立了甾体生物转化效率提升的新范式。研究成果不仅为左炔诺孕酮工业化生产提供高效菌株，其揭示的"线粒体隔离效应"为其他NADPH依赖型生物催化体系优化提供新思路。论文中开发的I180A突变体与NADPH再生联用策略，已展现出超越现有工艺(Geotrichum candidum
ZJPH1704)的竞争优势，为绿色制药技术发展注入新动能。