优化色氨酸合成途径基因CgAS显著提升球毛壳菌W7中chaetoglobosin A的产量及其机制研究

本研究针对chaetoglobosin A（cheA）合成效率低下的问题，通过生物信息学分析和启动子优化策略，在球毛壳菌W7中过表达色氨酸合成关键基因CgAS，使色氨酸积累量提升4.16倍，cheA产量达到217.81 mg/L（较野生型提高3.73倍）。研究揭示了前体积累通过激活氮代谢和次级代谢基因簇表达促进生物活性物质合成的机制，为生物农药和临床药物生产提供了新思路。

　　

在微生物天然产物开发领域，球毛壳菌（Chaetomium globosum）产生的chaetoglobosin A（cheA）因其对肿瘤细胞和植物病原体的显著抑制活性备受关注。然而，cheA的低产率和高合成成本严重制约其应用。色氨酸作为cheA生物合成的前体，其供给不足是限制产量的关键瓶颈。如何通过代谢工程策略突破前体限制，成为当前研究的难点。

针对这一挑战，来自浙江大学等机构的研究团队在《Synthetic and Systems Biotechnology》发表重要成果。研究人员首先通过生物信息学锁定色氨酸合成途径的限速酶——蒽酸合酶（anthranilic acid synthase, AS）编码基因CgAS，随后采用启动子优化技术构建高效表达系统。利用异源强启动子oliC驱动CgAS过表达后，工程菌株的色氨酸产量在发酵初期达263.91 mg/L（较野生型提高4.16倍），并显著激活了cheA生物合成基因簇的表达，最终使cheA产量提升至217.81 mg/L。该研究不仅建立了前体供给调控次级代谢的范例，更揭示了色氨酸积累通过强化氮代谢网络促进菌体生长和产物合成的双重机制。

研究团队主要运用了以下关键技术：1）生物信息学分析鉴定CgAS基因及其保守结构域；2）启动子强度评估系统（采用gpdA/trpC/oliC启动子驱动报告基因）；3）PEG介导的原生质体转化技术；4）HPLC定量检测色氨酸和cheA；5）qRT-PCR分析基因表达；6）扫描电镜和DAPI染色观察形态；7）LC-MS非靶向代谢组学分析。

3.1 CgAS基因特征分析
通过BLASTP比对发现CgAS（XP_001221698.1）编码770个氨基酸的多功能蛋白，系统发育分析显示其与Chaetomium tenue等近缘菌种相似度超93%。结构预测揭示该蛋白含PabA、IGPS和PRAI等典型结构域，其中PRAI结构域可催化色氨酸合成的关键步骤。

3.2 遗传操作系统开发
构建含gpdA/trpC/oliC启动子的报告载体，通过抗生素抗性和荧光强度评估发现oliC启动子驱动效率最高（HygR基因表达提升4.36倍）。基于此，研究人员选用oliC启动子构建CgAS过表达载体pHygR-oliC-AS。

3.3 色氨酸产量提升
工程菌株AS1和AS3在发酵4天时色氨酸产量分别达224.86 mg/L和263.91 mg/L，较野生型（64.47 mg/L）显著提高。代谢流分析表明过量色氨酸被分流至次级代谢途径，导致后期含量下降。

3.4 cheA产量与基因表达
CgAS过表达使cheA最高产量达217.81 mg/L（3.73倍于野生型）。qRT-PCR显示关键基因Cgpks、CgP450和CgcheR表达上调1.87-2.21倍，证实前体积累可激活次级代谢基因簇。

3.5 表型特征
扫描电镜显示工程菌株保持野生型形态，但孢子产量在培养4天时提升70%。DAPI染色证实菌丝隔膜数目（3-8个/细胞）未受影响，表明CgAS过表达仅加速生长而不改变发育模式。

3.6 代谢组学分析
LC-MS检测发现AS3中色氨酸衍生物（如IAA和4-吲哚甲醛）显著积累。KEGG富集显示精氨酸代谢、嘌呤代谢等通路被激活，伴随天冬氨酸、丝氨酸等氨基酸水平上升，证实氮代谢网络增强为菌体提供能量和合成前体。

这项研究创新性地证明：通过代谢工程改造色氨酸合成限速步骤，不仅能突破前体供给瓶颈，还可通过"氮代谢-次级代谢"协同效应提升目标产物产量。CgAS作为"代谢开关"的双重功能（促进菌体生长和cheA合成），为微生物细胞工厂的理性设计提供了新策略。研究建立的启动子优化系统和多组学分析框架，也为其他高价值天然产物的异源合成提供了技术范式。未来结合前体分流调控和发酵工艺优化，有望进一步降低cheA生产成本，推动其作为抗癌药物和生物农药的产业化进程。