CRISPR-Cas13a联合重组酶辅助扩增技术：一种可视化超灵敏即时检测蛋鸡减蛋综合征病毒的新方法

为解决蛋鸡减蛋综合征病毒（EDSV）临床检测灵敏度不足的问题，研究人员开发了一种基于CRISPR-Cas13a与重组酶辅助扩增（RAA）的即时检测技术。该方法可在30-50分钟内实现1 copy/μL的超灵敏检测，特异性强（无MDV/ILTV等交叉反应），临床样本验证显示与PCR的总体符合率达98.57%（κ=0.94），为EDSV流行病学研究提供了高效工具。

蛋鸡减蛋综合征病毒（EDSV）是全球禽类养殖业的重要病原体，感染后会导致产蛋率下降20%-50%，并引发无壳蛋、软壳蛋等异常现象，造成巨大经济损失。传统PCR检测虽为金标准，但存在设备依赖性强、耗时长等局限。而新兴的CRISPR-Cas系统虽具备单碱基特异性，但需依赖预扩增步骤提升灵敏度。如何整合两项技术实现现场快速、超灵敏检测，成为当前研究的突破口。

河南农业大学禽病研究所的研究团队在《Talanta》发表论文，创新性地将重组酶辅助扩增（RAA）与CRISPR-Cas13a系统耦合，开发出首个EDSV可视化即时检测方法。研究通过优化Cas13a蛋白（2.4 mg/mL）和crRNA（100 μg/μL）浓度，建立了一套可在39-42°C下完成的检测体系。关键技术包括：RAA等温扩增靶标DNA、体外转录生成RNA、Cas13a-crRNA复合物特异性识别及荧光报告分子切割。临床验证采用210份样本，涵盖MDV、ILTV等10种常见禽病原体对照。

【Test Samples】
研究使用河南农业大学提供的EDSV毒株及210份临床样本，同时纳入MDV、ALV等10种禽类病毒作为特异性对照。

【Expression of Cas13a Protein】
将pC013-Twinstrep-SUMO-huLwaCas13a质粒转化至Rosetta 2(DE3)PlysS细胞，经IPTG诱导后获得138.5 k Da的Cas13a蛋白。

【Results of Cas13a Protein Purification and Protein Activity Verification】
镍柱纯化后蛋白浓度达2.4 mg/mL，活性验证显示其可高效切割靶RNA（与商业Cas13a效率相当）。

【Discussion】
该技术突破传统PCR的局限，检测限达1 copy/μL，且对H9N2 AIV、FAdV-4/8/11等均无交叉反应。组内/组间变异系数<4%，临床样本阳性符合率100%，阴性符合率98.35%，显著优于现有方法。

研究首次将CRISPR-Cas13a系统应用于EDSV检测领域，不仅为禽病防控提供了"样本进-结果出"的现场解决方案，更拓展了RAA-CRISPR联用技术在兽医诊断学的应用场景。该成果对实现禽类病毒感染的早期预警和精准防控具有重要实践意义，其模块化设计思路也为其他动物病原检测提供了技术范式。