基于Ty反转录转座子元件的酿酒酵母多拷贝整合工具包开发及其在高效蛋白表达与黄酮合成中的应用

本研究针对酿酒酵母(S. cerevisiae)中基因单拷贝整合表达水平低、质粒表达不稳定的问题，开发了基于Ty反转录转座子元件的多拷贝整合工具包。通过优化9种选择标记(包括TRP1anti deg、KlLEU2GUG deg等)在5类Ty位点(Ty1Cons1/2、Ty2Cons等)的整合效率，实现了phiYFP蛋白产量达1.6 g/L(占胞内总蛋白48.8%)，并将14个紫杉叶素(taxifolin)合成途径基因分三组整合，产量达277.6 mg/L。该工具为真核生物高效表达系统提供了新范式。

　　

在合成生物学和生物制造领域，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)因其完善的蛋白翻译后修饰系统和安全性，成为表达复杂真核蛋白和合成高价值化合物的理想宿主。然而，传统表达方式面临严峻挑战：质粒表达存在遗传不稳定性，而单拷贝基因组整合又难以满足工业化生产对表达量的需求。特别是对于需要多基因协同作用的复杂代谢途径，如何实现多个基因的高效、稳定表达成为制约产量提升的关键瓶颈。

针对这一难题，中国研究人员开发了基于Ty反转录转座子元件的多拷贝整合工具包。Ty元件是酿酒酵母基因组中广泛分布的重复序列，其长末端重复序列(LTR)可作为同源重组位点。研究团队系统分析了CEN.PK2-1D菌株中五类Ty元件(Ty1Cons1/2、Ty2Cons、Ty3Cons、Ty4Cons)的分布特征，发现这些元件在基因组中呈现随机分布且拷贝数高达数十至数百个，其mRNA占比达5-10%，暗示其具有强转录活性。

研究采用的主要技术包括：1) 通过Gibson组装构建含不同选择标记和Ty-LTR的55种质粒库；2) 使用RT-qPCR和荧光激活细胞分选(FACS)定量整合拷贝数；3) 采用高压均质和SDS-PAGE分析重组蛋白产量；4) 通过HPLC检测紫杉叶素合成途径中间产物。

研究结果方面，在"3.1 多拷贝整合工具包的特征"部分，作者通过优化选择标记的启动子强度和起始密码子(AUG→GUG/AAG)，显著提高了ScTRP1^anti
deg和KlLEU2_GUG
deg标记的整合效率。工具包允许同时使用6种高效选择标记(TRP1^anti
deg、KlLEU2_GUG
deg、KlURA3deg、SpHIS5deg、natMXdeg、hphMXdeg)在多个Ty位点进行整合。

"3.3 整合菌株的拷贝数分布"显示，与游离质粒表达相比，Ty整合菌株在相同拷贝数下荧光强度提高2-3倍。当EGFP拷贝数达19时，荧光强度超过500,000，且FACS检测显示所有细胞呈现均一的高表达峰，证明整合系统的稳定性。

在"3.4 工具包在蛋白过表达中的应用"中，phiYFP在KlURA3deg标记整合菌株中产量达1.6 g/L(268.1 mg/g DCW)，占胞内总蛋白48.8%。值得注意的是，KlURA3的整合同时修复了尿嘧啶合成途径，使菌体密度(OD₆₀₀
=21.5)显著高于其他选择标记菌株。

"3.5 工具包在途径构建中的应用"展示了14个紫杉叶素合成基因的分模块整合策略。通过将苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)等基因分为三个模块，分别用不同选择标记整合至Ty1、Ty2和Ty3位点，最终菌株Y732在5-L生物反应器中产量达277.6 mg/L。有趣的是，模块IA(产生毒性中间体肉桂酸)的拷贝数需控制在较低水平(2-8拷贝)，而模块III(黄酮合成关键酶)拷贝数可达16。

讨论部分指出，该工具包突破了酿酒酵母表达系统的关键限制：1) 整合位点从传统的rDNA(易发生同源重组)扩展到五类Ty位点；2) 通过降解信号(CL-1)和弱化翻译起始(非AUG密码子)平衡选择标记表达；3) 最大支持8.4 kb大片段整合。与CRISPR介导的多拷贝整合相比，该方法仅需单次转化即可获得高拷贝菌株。

该研究的创新性体现在：首次系统比较了不同选择标记在五类Ty位点的整合效率，建立了标准化的多基因整合策略；phiYFP产量创酿酒酵母报道新高；为复杂途径的平衡表达提供了新思路。未来可通过引入更多选择标记(如ARG8、dsdAMX等)进一步扩展工具包应用范围，但在表达毒性蛋白或代谢物时需注意拷贝数调控与诱导时序的优化。

这项工作为真核合成生物学提供了重要工具，其设计理念(利用基因组重复元件实现多拷贝整合)也可推广至其他工业微生物，如大肠杆菌(IS元件)、芽孢杆菌(Bacillus)等。随着对Ty元件调控机制的深入解析，有望开发出更精准的整合表达系统，推动生物制造产业的升级发展。