基于定向进化策略的L-肉碱生物传感器动态范围扩展研究及其在代谢工程中的应用

本研究针对L-肉碱生物传感器检测范围受限的问题，通过计算机辅助设计结合定向进化技术对转录因子CaiF进行改造，成功开发出动态范围扩展1000倍（10?4 –10 mM）、信号强度提升3.3倍的突变体CaiFY47W/R89A ，为L-肉碱高产菌株筛选提供了高效工具。

　　

L-肉碱（L-carnitine）作为真核生物能量代谢的关键分子，在心血管疾病治疗和功能性食品领域具有重要价值。然而传统化学生产工艺复杂昂贵，微生物合成又面临缺乏高效检测工具的瓶颈。现有基于转录因子CaiF的生物传感器仅能响应10^?4
–10^?1
mM的L-肉碱，严重制约高产菌株筛选效率。

为解决这一难题，中国研究人员通过多学科交叉策略开展创新研究。他们首先利用AlphaFold3预测CaiF-DNA复合物结构，结合丙氨酸扫描鉴定出Y11、R75等关键DNA结合位点。随后采用"功能多样性导向的体积保守替换"策略，对CaiF进行系统性改造。最终获得的CaiF^Y47W/R89A
突变体将检测范围扩展至10^?4
–10 mM，信号输出强度提升3.3倍，相关成果发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》。

研究团队主要运用了四项关键技术：1）基于AlphaFold3的蛋白质-DNA复合物结构预测；2）分子动力学模拟分析结合能变化；3）CRISPR/Cas9基因组编辑构建ΔcaiA工程菌株；4）功能多样性导向的位点组合突变策略。

【3.1 设计L-肉碱体内激活生物传感器】
通过比较sfGFP与mCherry报告系统，选定sfGFP构建生物传感器。在BW25113(DE3)ΔcaiA菌株中验证其响应范围为10^?4
–10^?2
mM，发现葡萄糖抑制效应后改用甘油培养基提升灵敏度。

【3.2 鉴定转录因子CaiF关键结合位点】
结构模拟揭示R75与DNA形成氢键网络，实验证实R75A突变使结合能降低40 kcal/mol。丙氨酸扫描发现Y11A等突变显著降低荧光信号，而S93A等突变则增强响应，为后续改造提供靶点。

【3.3 扩展生物传感器动态范围】
体积保守替换策略获得Y47W突变体，响应范围扩至10^?4
–10^?1
mM，荧光强度翻倍。Y11L突变体则展现10^?3
–1 mM的宽范围响应特性。

【3.4 开发高输出宽范围突变体】
组合突变获得突破性成果：Y47W/R89A突变体实现10^?4
–10 mM检测范围（较野生型提升1000倍），10 mM时信号值达10970（较对照高3.3倍）；Y11L/N92A突变体响应范围达10^?4
–10 mM，信号强度提升5.5倍。

这项研究通过结构引导的理性设计成功突破生物传感器性能瓶颈。CaiF^Y47W/R89A
突变体的卓越表现不仅为L-肉碱代谢工程提供强大工具，其研发策略更为转录因子改造提供新范式。研究揭示的R75-DNA相互作用机制为理解转录调控提供新见解，而体积保守替换策略可推广至其他蛋白工程领域。尽管当前仍面临结构解析不足等挑战，但该工作展示的计算与实验相结合的方法，为未来开发更高性能生物传感器指明方向。