枯草芽孢杆菌中T7 RNA聚合酶引导的碱基编辑器加速连续进化的研究

为解决枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)缺乏高效连续进化系统的问题，研究人员开发了BS-MutaT7系统，通过融合碱基脱氨酶与T7 RNA聚合酶(T7RNAP)，实现了靶向基因组的高效突变。该系统在5 kb区域内维持高突变率(5.8×10?5 s.p.b.)，使四环素耐药性提升16倍，β-乳球蛋白(β-Lg)产量达3.92 g/L。该研究为原核生物基因组规模进化提供了新工具，发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》。

　　

在合成生物学和工业微生物领域，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)因其卓越的蛋白分泌能力和安全性，被誉为"微生物细胞工厂"。然而，这种革兰氏阳性菌长期面临一个关键瓶颈——缺乏高效的连续定向进化(CDE)系统。传统CRISPR碱基编辑系统存在编辑窗口窄、需多gRNA等局限，而T7RNAP引导的进化系统虽在Escherichia coli等微生物中成功应用，却因表达调控和融合蛋白兼容性问题未能在B. subtilis中建立。

江南大学的研究团队创新性地开发了BS-MutaT7系统。通过构建包含7种脱氨酶和14种连接子的文库，筛选出两种最优融合构型：TadA8e直接融合T7RNAP的BS-MutaT7^A
(突变率1.2×10^?5
s.p.b.)，以及PmCDA1通过(GGGGS)₃
连接子融合T7RNAP并共表达UGI的BS-MutaT7^C
(突变率5.8×10^?5
s.p.b.)。该系统采用温度敏感型质粒实现可诱导表达，通过T7启动子(P_T7
)精准定位靶基因，结合终止子阵列控制突变范围。

关键技术包括：1) 基于Luria-Delbrück波动分析的突变率计算；2) 双报告基因系统(erythromycin抗性基因和GFP)评估编辑效率；3) 流式细胞术筛选高产β-Lg突变体；4) 5-L发酵罐规模验证。

研究结果显示：

1. 系统优化：BS-MutaT7^C
   在5 kb区域内保持2.9×10^?5
   s.p.b.的持续突变活性，脱靶率仅1.7×10^?8
   s.p.b.。
2. 四环素进化：通过连续传代使tetK基因产生V128A等突变，替加环素耐受性提升16倍(8 μg/mL)。
3. 全局调控：改造转录调控因子CodY(L245P突变)使β-Lg产量提升37.8%，发酵产量达3.92 g/L。

该研究突破性地解决了三个关键问题：首先，建立了首个适用于B. subtilis的T7RNAP引导进化系统；其次，通过连接子工程优化了融合蛋白功能；最后，证实系统在长片段基因和全局调控网络进化中的实用性。值得注意的是，相比腺嘌呤脱氨系统(BS-MutaT7^A
)，胞嘧啶脱氨系统(BS-MutaT7^C
)展现出更优的编辑效率，这可能与PmCDA1更高的催化活性有关。

在应用层面，研究团队创新性地将系统应用于：1) 膜转运蛋白TetK的快速进化，为抗生素耐药性研究提供模型；2) 全局调控因子CodY的定向改造，证明其对代谢网络的重编程能力。特别是通过CodY突变体V171I/D208N实现β-Lg高产，展现了系统在重组蛋白生产中的巨大潜力。

这项发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》的研究，不仅填补了革兰氏阳性菌连续进化技术的空白，更为微生物基因组工程提供了模块化解决方案。未来通过开发多脱氨酶复合体，有望进一步扩展突变谱系，推动B. subtilis在合成生物学和工业生物技术中的应用边界。