毕赤酵母启动子工程改造促进3-羟基丙酸高效合成：碳源非依赖性表达与代谢通路优化

本研究针对毕赤酵母(Pichia pastoris)中碳源依赖性启动子限制长代谢通路构建的难题，通过绘制中心代谢通路基因表达图谱并改造启动子上游序列，开发出强度达PGAP 90%的人工启动子PS2 。利用该启动子整合β-丙氨酸与丙二酰辅酶A通路，结合代谢工程策略使工程菌CHP9/CHP20以甲醇为碳源实现3-HP产量23 g/L，为甲醇生物转化体系提供了关键工具并奠定工业化基础。

　　

在绿色生物制造领域，毕赤酵母(Pichia pastoris)因其卓越的甲醇代谢能力被视为理想细胞工厂。然而，该体系长期受限于碳源依赖性启动子——强启动子P_GAP
仅在葡萄糖中高效工作，而甲醇诱导型启动子AOX1存在表达不稳定的缺陷。这种"碳源切换困境"严重阻碍了含长代谢通路化学品（如平台化合物3-羟基丙酸3-HP）的微生物合成。更棘手的是，β-丙氨酸与丙二酰辅酶A两条3-HP合成前体通路的协调表达需要精确的启动子强度调控，现有启动子工具箱难以满足需求。

针对这一瓶颈，中国科学院研究人员在《Synthetic and Systems Biotechnology》发表的研究中，首次系统绘制了毕赤酵母中心代谢通路基因在甲醇/葡萄糖条件下的表达图谱。通过比较转录组学锁定候选启动子，采用上游序列截短和顺式元件重组策略，成功开发出碳源非依赖性人工启动子P_S2
。该启动子在甲醇条件下表达强度达到P_GAP
的90%，且不受葡萄糖抑制。基于此构建的β-丙氨酸-丙二酰辅酶A杂合通路，结合基因剂量优化和副产物阻断策略，使工程菌株3-HP产量突破23 g/L，创造了甲醇生物转化合成3-HP的最高纪录。

关键技术包括：1) 双碳源条件下转录组测序构建基因表达矩阵；2) 启动子上游序列系统性截短与强度评估；3) 代谢通量分析指导通路平衡优化；4) CRISPR-Cas9介导的多基因位点整合。

启动子强度图谱揭示碳源响应规律
通过RNA-seq分析鉴定了58个中心代谢基因在甲醇/葡萄糖中的表达差异，发现糖酵解基因在葡萄糖中表达量普遍比甲醇高3-8倍，而甲醇代谢相关基因呈现相反趋势。特别值得注意的是，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAP启动子P_GAP
在葡萄糖中活性比甲醇高12倍，这解释了传统工程菌在碳源切换时性能骤降的原因。

人工启动子P_S2
的开发
选择组蛋白H3基因启动子为骨架，通过5'端逐段删除发现-298至-1区段对维持高强度至关重要。引入合成的转录增强子元件后，改造获得的P_S2
在甲醇中驱动eGFP表达达到P_GAP
的90%，且在不同碳源间波动小于15%。凝胶迁移实验证实该区域含有新型碳源非依赖性转录因子结合位点。

杂合代谢通路构建与优化
将P_S2
应用于3-HP合成：β-丙氨酸通路中乙酰-CoA羧化酶acc1和β-丙氨酸转氨酶patD采用单拷贝整合，而丙二酰辅酶A还原酶mcr需三拷贝表达才能平衡前体供应。通过敲除丙酮酸脱羧酶基因PDC5减少乙酸积累，最终获得CHP9和CHP20两株高性能菌株。

发酵性能验证
5L发酵罐中，工程菌在72小时内将甲醇完全转化为3-HP，产量分别达到23 g/L和22 g/L，碳转化率为0.31 g/g，较原始菌株提升6.8倍。代谢流分析显示改造后丙二酰辅酶A节点通量增加4.2倍，且TCA循环与乙醛酸分流比优化至3:1。

该研究不仅扩充了毕赤酵母遗传工具库，更开创性地解决了碳源依赖这一领域核心难题。P_S2
启动子的碳源非依赖性特性为复杂代谢通路协调表达提供了新范式，而23 g/L的3-HP产量标志着甲醇生物转化技术向工业化迈出关键一步。研究者特别指出，这种启动子工程策略可推广至其他甲基营养型酵母，为C1原料生物制造高值化学品开辟了新路径。