基于生物素化融合蛋白-链霉亲和素-过氧化物酶复合物的非竞争性磁免疫分析法快速检测有机磷农药

本研究针对有机磷农药（OPs）残留检测中噬菌体展示肽的安全性和二次试剂依赖性问题，开发了一种基于SIC2肽-谷胱甘肽S-转移酶（GST）-生物素受体域（BAD）融合蛋白的新型非竞争性磁免疫分析法（NCMIA）。该方法通过生物素-链霉亲和素系统放大信号，实现了12种OPs的快速检测（LODs 1.04-13.18 ng mL-1 ），11分钟内完成分析，在蔬菜样本中回收率达79.91%-103.72%，与GC-MS/MS结果一致，为农药残留监测提供了安全高效的新策略。

　　

论文解读
有机磷农药（Organophosphorus pesticides, OPs）作为全球使用最广泛的杀虫剂之一，其残留问题严重威胁食品安全和人类健康。传统检测方法如气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）虽然准确，但设备昂贵、操作复杂。免疫分析法因其快速、低成本的优势成为现场检测的首选，但现有噬菌体展示肽介导的非竞争性免疫分析存在生物安全风险，且依赖二次标记试剂，制约了实际应用。

为解决这一技术瓶颈，研究人员创新性地将能识别单链抗体片段5（scFv5）-OPs免疫复合物的SIC2肽，与谷胱甘肽S-转移酶（GST）和生物素受体域（BAD）基因融合，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并生物素化。该融合蛋白通过生物素-链霉亲和素系统高效结合链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）复合物，催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）显色放大信号。结合免疫磁珠分离技术，建立了11分钟即可完成的非竞争性磁免疫分析法（NCMIA）。

关键技术方法
研究采用分子克隆构建GST-BAD-SIC2融合表达载体，通过大肠杆菌表达系统生产重组蛋白，经体外生物素化后与SA-HRP形成检测复合物。以黄瓜、卷心菜和生菜为实际样本，采用免疫磁珠富集目标物，通过TMB-H₂
O₂
显色体系定量分析，并与GC-MS/MS进行方法学比对。

研究结果

1. 融合蛋白表达与表征：SDS-PAGE证实成功获得约52 kDa的GST-BAD-SIC2融合蛋白，生物素化效率达90%以上，与SA-HRP结合后显著增强信号强度。
2. 分析性能优化：在pH 7.4、25℃条件下，该方法对12种OPs的检测限为1.04-13.18 ng mL^-1
   ，较传统ELISA灵敏度提高3-5倍。
3. 实际样本验证：三种蔬菜中甲基对硫磷、毒死蜱和丙溴磷的批内/批间回收率为79.91%-103.72%，变异系数≤14.98%，与GC-MS/MS结果的相关系数R²

0.95。

结论与意义
该研究首次将生物素化融合蛋白替代噬菌体肽应用于OPs检测，消除了生物安全隐患，通过级联信号放大实现超灵敏分析。NCMIA的短时检测特性（11分钟）使其适用于农产品市场快速筛查，79.91%-103.72%的回收率满足国际食品法典委员会（CAC）对农药残留检测的要求。该方法为小分子污染物检测提供了通用技术平台，相关成果发表于《Talanta Open》，对推动食品安全监测技术进步具有重要价值。