靶向噬菌体末端酶基因(terL)的实时PCR对欧洲人类伯氏疏螺旋体感染的诊断价值评估

本研究针对Shan等提出的靶向噬菌体末端酶基因(terL)的实时PCR在欧洲莱姆病(LB)诊断中的适用性展开验证。通过分析培养菌株、血清及组织样本，发现该PCR无法稳定检测欧洲主要致病种B. afzelii和B. garinii，血清样本全部阴性。研究否定了terL PCR在欧洲LB诊断中的可靠性，为临床检测方法选择提供关键依据。

　　

莱姆病作为由伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi sensu lato, Bb sl)复合体引发的蜱传疾病，其诊断始终面临挑战。尽管PCR技术在感染性疾病诊断中发挥重要作用，但在莱姆病诊断中仍作为辅助手段。2021年Shan等提出靶向噬菌体末端酶大亚基基因(terL)的多拷贝实时PCR方案，声称可显著提升诊断灵敏度，尤其适用于血清检测。这一突破性主张引发学界关注，但欧洲主要致病种B. afzelii和B. garinii的检测效能尚不明确，且血清中噬菌体DNA存在的假说缺乏临床验证。

德国国家伯氏疏螺旋体参考中心联合瑞典、奥地利等多国研究机构，在《Ticks and Tick-borne Diseases》发表重要研究。团队系统评估了terL PCR对欧洲流行菌株的检测能力，涵盖32株培养菌株（含10株B. afzelii和6株B. garinii）、15例确诊患者血清及26例组织样本，并行对照flaB、ospA等靶点PCR。研究采用三种实验室独立验证模式，使用不同品牌双淬灭探针（ZEN/IBFQ、abNFQ/NFQ）和单淬灭探针（BHQ1），并建立标准化DNA稀释面板（10⁴
-10^-1
GE/5μl）进行灵敏度比较。

3.1 terL PCR存在显著物种检测偏倚
培养菌株测试显示，所有B. burgdorferi sensu stricto(ss)样本均获阳性，但B. afzelii仅60%（6/10）、B. garinii仅33%（2/6）检出。值得注意的是，阴性样本在flaB对照PCR中Ct值稳定（16.86-19.31），证实DNA质量可靠。DNA稀释面板实验进一步验证，B. afzelii PKo株仅在最高浓度（10⁴
GE）呈弱阳性（Ct=40.8），而10³
GE即转阴。基因组分析确认阴性菌株均含cp32质粒（如PVPM含8个cp32），排除靶基因缺失可能。

3.2 血清与组织样本验证诊断失败
15例经血清学/培养确诊的LB患者血清中，terL PCR全部阴性，包括5例经培养验证的B. afzelii感染。26例组织样本中，57%（15/26）呈假阴性，包含9例B. afzelii和2例B. garinii感染。值得注意的是，3例B. burgdorferi ss关节炎患者的关节液检出阳性（Ct=30.17-34.47），但对应flaB PCR Ct值更低（31.02-34.08），显示terL灵敏度并无优势。

4.1 方法学局限性解析
研究指出terL PCR设计基于B. burgdorferi ss序列，虽计算机模拟提示广谱性，但实际引物-模板错配可能导致欧洲菌株漏检。双淬灭探针（ZEN/IFBQ）虽较单淬灭（BHQ1）平均降低Ct值1-3个循环（如B31株12.33→10.53），但无法改变阴性样本结果。值得注意的是，使用PrimeTime master mix时，flaB PCR灵敏度反而低于QuantiTect体系，提示试剂优化空间。

4.2 血清诊断假说被证伪
作者驳斥了"噬菌体自发释放入血"的理论依据：首先，Bb sl在血流中存活时间极短（小鼠模型<24小时）；其次，Eggers等早证实B. afzelii/B. garinii培养中极少自发释放噬菌体。研究特别强调，Shan等报道的健康对照阳性可能反映非特异性扩增，而非隐性感染。

这项多中心研究以严谨的实验设计证实：现行terL PCR方案存在地域适用性缺陷，无法满足欧洲LB诊断需求。其价值可能局限于北美B. burgdorferi ss流行区，而对占欧洲病例90%以上的B. afzelii/B. garinii检测不可靠。研究团队建议诊断实验室继续沿用flaB、ospA等单拷贝基因靶点，或开发覆盖所有致病种的广谱terL引物体系。该成果为全球LB诊断指南的修订提供了关键实验证据，避免了潜在的大规模假阴性误诊风险。