鸡原始卵泡在绒毛尿囊膜共培养体系中的异体激活与生殖质调控网络解析

本研究针对禽类原始卵泡早期发育调控机制不清的问题，建立基于绒毛尿囊膜(CAM)的异体共培养体系(CAM-assay)，通过脂质体转染siRNA干扰Bucky ball和CVH基因表达，揭示生殖质组织因子在卵泡发育中的时空特异性调控。采用替代蛋壳培养技术显著提升卵泡存活率至75%，为禽类生殖细胞发育研究提供创新平台。

　　

在禽类生殖生物学领域，卵泡发育早期阶段的调控机制长期存在认知空白。鸡作为典型卵生脊椎动物，其卵泡发育过程中经历从数百万原始生殖细胞(PGCs)到最终约5000个初级卵泡的剧烈筛选，但这一过程的分子调控网络仍不明确。尤其令人困惑的是生殖质(决定生殖细胞命运的胞质成分)在Balbiani小体(卵母细胞特化的细胞器)中的动态积累过程，以及母源因子Bucky ball(生殖质组织蛋白)如何介导这一过程。传统细胞培养体系难以模拟卵泡三维微环境，而体内研究又受限于卵巢解剖复杂性，这成为阻碍机制研究的重大技术瓶颈。

针对这一挑战，Friedrich-Loeffler-Institut的研究团队创新性地将绒毛尿囊膜(CAM)培养技术应用于禽类卵泡研究。CAM作为胚胎发育过程中负责气体交换和营养运输的临时器官，具有高度血管化的三维结构，此前已被用于肿瘤移植和血管生成研究。研究人员通过比较开窗蛋壳与替代蛋壳两种培养系统，结合脂质体介导的siRNA转染技术，首次实现了对鸡原始卵泡的基因功能研究。

关键技术方法包括：1)从成年母鸡卵巢分离三类不同直径(AA:<100μm、BB:100-300μm、CC:300-600μm)的卵泡；2)采用脂质体3000?转染Bucky ball和CVH(鸡vasa同源物)特异性siRNA；3)在胚胎第5天(E5)或第8天(E8)将卵泡植入预孵化的CAM；4)通过替代蛋壳技术(35mm开口)优化培养条件；5)48-96小时后评估卵泡存活率及血管化程度。

3.1 异种移植验证体系可行性
通过移植mCherry荧光标记的小鼠卵丘-卵母细胞复合体(COCs)至鸡胚胎CAM，证实异种组织可在禽类CAM中存活超过24小时，为后续实验提供技术参照。

3.2 鸡卵泡的CAM整合与基因干扰
成功实现Cy5标记的scrambled siRNA在80-150μm卵泡中的转染与追踪。E8植入的卵泡表现出显著优于E5的血管化效率，48小时内即可形成密集的毛细血管网络包裹卵泡。

3.3 培养系统比较研究
替代蛋壳系统展现出压倒性优势：胚胎存活率达80%，卵泡回收率75%(E8植入)，显著高于开窗蛋壳的30%存活率和25%回收率。关键突破在于35mm大开口提供的操作空间和稳定培养环境。

3.4 发育阶段依赖性整合
E5时期CAM尚未完全附着蛋壳，植入卵泡易发生位移；而E8时成熟的三层CAM结构可牢固固定卵泡，并通过"套叠式微血管生长"机制快速建立血供。

这项研究通过技术创新解决了禽类卵泡研究的三大核心难题：1)建立首个可支持300-600μm卵泡长期(4天)存活的异体培养系统；2)证实Bucky ball在卵泡发育阶段特异性表达模式(从颗粒细胞向Balbiani小体再向卵周隙的动态转移)；3)揭示E8是卵泡植入的最佳时间窗，此时CAM的血管重塑能力最强。

特别值得注意的是，替代蛋壳技术将实验成功率提升2-3倍，这一突破不仅适用于卵泡研究，更为其他CAM相关实验提供了标准化方案。研究首次证明禽类原始卵泡可在脱离卵巢环境后维持正常发育程序，这为生殖细胞冷冻保存、濒危禽类保护等应用奠定了理论基础。

对Bucky ball和CVH的RNA干扰实验初步揭示了生殖质调控网络的复杂性，后续可通过该平台系统筛选更多生殖相关基因。从转化医学角度看，该CAM-assay可作为药物筛选模型，用于开发改善家禽繁殖性能的调控剂。论文发表于《Theriogenology》，为生殖生物学研究提供了新的技术范式。