一氧化氮通过RhoA–ROCK-KIF15信号轴调控山羊卵母细胞纺锤体动态的新机制

本研究针对山羊卵母细胞成熟过程中纺锤体动态调控机制不明的科学问题，通过抑制一氧化氮合酶（NOS）活性并结合NO供体SNP干预，首次揭示NO通过RhoA–ROCK通路调控KIF15表达，进而影响MI期纺锤体组装和染色体分离的分子机制。该成果发表于《Theriogenology》，为改善反刍动物生殖效率提供了新靶点。

　　

在哺乳动物生殖生物学领域，卵母细胞成熟质量直接决定胚胎发育潜能。这一复杂过程的核心在于减数分裂中纺锤体的精确组装，其异常可导致染色体非整倍性——目前人类流产和牲畜繁殖障碍的主要诱因之一。尽管一氧化氮（NO）已被证实参与多物种卵母细胞成熟调控，但其在山羊中的作用机制仍属空白，特别是NO是否通过纺锤体动态影响减数分裂进程尚不清楚。

中国农业科学院的研究团队在《Theriogenology》发表的研究中，首次系统解析了NO通过RhoA–ROCK-KIF15信号轴调控山羊卵母细胞纺锤体动态的分子机制。研究采用L-NMMA抑制NOS活性建立NO缺陷模型，结合NO供体硝普钠（SNP）挽救实验，通过免疫荧光染色、蛋白质组学和信号通路抑制剂干预等关键技术，发现：

主要技术方法

1. 免疫荧光定位eNOS/iNOS/nNOS蛋白时空表达
2. 微管乙酰化检测（抗acetyl-α-tubulin抗体）
3. 纺锤体形态学分析（α-tubulin-FITC染色）
4. 蛋白质组学筛选差异表达蛋白
5. RhoA磷酸化水平检测（ROCK抑制剂Y-27632验证）

研究结果

NOS与NO在山羊卵母细胞中的表达特征
三种NOS亚型（eNOS/iNOS/nNOS）均定位于卵母细胞胞质，GVBD期和MI期NO含量显著升高，提示NO可能参与减数分裂重启关键事件。

NO缺陷导致减数分裂阻滞
L-NMMA处理组卵母细胞成熟率下降23.7%，且60%阻滞于MI期。纺锤体呈现桶状结构破坏、微管过度乙酰化，伴随纺锤体组装检查点（SAC）持续激活，证实NO缺失直接损害纺锤体功能。

KIF15是NO调控的关键效应分子
蛋白质组学发现L-NMMA组KIF15表达下调2.1倍。该驱动蛋白家族成员已知参与微管滑动，其减少导致染色体列队异常——这通过SNP补充实验得到部分逆转。

RhoA–ROCK通路介导NO信号传递
NO缺陷使RhoA磷酸化水平升高3倍，而ROCK抑制剂处理可恢复KIF15表达。首次证实NO通过抑制RhoA–ROCK通路维持KIF15蛋白稳态，从而保障纺锤体动态平衡。

结论与意义
该研究构建了"NO–RhoA–ROCK–KIF15–纺锤体动态"的完整调控轴，阐明NO通过负调控RhoA磷酸化解除其对KIF15的抑制作用，最终保证MI期纺锤体正常组装（图8）。这不仅填补了反刍动物生殖调控的理论空白，更为临床改善山羊等经济动物卵母细胞质量提供了新策略——通过靶向NO信号通路可能减少胚胎非整倍体发生率。研究还提示KIF15可作为评估卵母细胞成熟度的新型分子标记物。