TK6细胞系共表达四种人细胞色素P450酶在遗传毒性测试中的应用与评估

为解决体外遗传毒性测试中代谢活化依赖啮齿动物肝S9组分的局限性，美国食品药品监督管理局（FDA）研究人员开发了共表达CYP2A6、2E1、2C19和3A4的TK6-4CYP细胞系。通过RNA测序、Western blot和UPLC-MS验证酶活性，并利用微核试验、细胞周期分析和彗星试验证实其对前遗传毒性化合物（如NDEA、NDMA）的代谢活化能力。该研究为多酶共表达模型在遗传毒性评估中的应用提供了概念验证。

　　

研究背景与意义
在药物安全评估中，体外遗传毒性测试是识别潜在致癌物的关键环节。然而，传统方法依赖啮齿动物肝S9组分进行代谢活化，存在种属差异大、批次不稳定等缺陷。随着监管机构（如FDA、OECD）对测试系统代谢能力要求的提高，开发人源化代谢模型成为迫切需求。TK6人淋巴母细胞系因其基因组稳定性和低背景突变率被广泛用于遗传毒性测试，但其内源性细胞色素P450（Cytochrome P450, CYP）表达缺失，限制了直接应用。

美国食品药品监督管理局的研究团队此前已构建14种单CYP表达的TK6细胞系，证实其可替代S9组分激活前遗传毒性物质。但逐个测试效率低下，亟需开发多酶共表达系统。本研究选择CYP2A6、2E1、2C19和3A4四种关键代谢酶（覆盖77%致癌物激活反应），首次在TK6细胞中实现共表达，建立TK6-4CYP模型，为高通量遗传毒性筛查提供新工具。

关键技术方法
研究采用慢病毒载体分步转导策略，将CYP2A6/2E1和CYP2C19/3A4组合导入TK6细胞。通过qPCR、Western blot和超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）验证基因表达、蛋白水平和酶活性。选用四种典型前遗传毒性化合物（NDEA、NDMA、NNP和riddelliine），通过微核试验（OECD TG 487）、细胞周期分析和彗星试验评估代谢活化效果。

研究结果

1. 四重CYP在TK6-4CYP细胞中的表达验证
RNA测序显示四种CYP mRNA表达较亲本细胞提升>2¹⁰
倍，且无其他CYP基因干扰性上调。Western blot证实蛋白表达，UPLC-MS检测到特异性代谢产物（如CYP2E1介导的NDMA脱甲基化），酶活性与单表达细胞系相当。

2. 遗传毒性终点检测

• 微核试验：NDEA（CYP2A6底物）、NDMA（CYP2E1底物）和NNP（CYP2C19底物）均显著增加微核率（p<0.01），riddelliine（CYP3A4底物）仅显示微弱效应。
• 细胞周期分析：四化合物均引起G2/M期阻滞，提示DNA损伤修复激活。
• 彗星试验：仅riddelliine未诱导显著DNA链断裂（%尾DNA无变化），可能与CYP3A4代谢路径差异有关。

讨论与结论
TK6-4CYP模型成功模拟了人体对多类前遗传毒性化合物的代谢活化，其优势在于：

1. 特异性：明确区分不同CYP的底物偏好性，如CYP2E1对NDMA的高效活化；
2. 高通量：单次实验可评估多酶协同作用，较单CYP细胞系提升效率；
3. 监管兼容性：结果符合OECD测试指南（如TG 487），便于转化应用。

局限性在于尚未覆盖所有关键CYP（如CYP1A2），且对某些化合物（如riddelliine）的敏感性有待优化。未来可扩展至更多酶组合或引入相位II代谢酶（如UGT、SULT）。该研究为替代动物源性S9组分提供了可靠方案，推动体外遗传毒性测试向更精准、人源化的方向发展。论文发表于《Toxicology in Vitro》，为药物安全评估领域树立了新标杆。