基因工程Caco-2细胞模型：评估药物代谢酶介导的肠屏障毒性机制与安全性研究

本研究针对传统Caco-2细胞模型与人类肠道代谢酶谱差异的局限性，开发了CES1敲除/CYP3A4/UGT1A1共表达的基因工程Caco-2细胞系。通过伊立替康（CPT-11）及其代谢产物SN-38的毒性实验，证实该模型能更准确评估药物代谢酶（CES/CYP3A4/UGT1A1）对肠屏障完整性的影响，为药物安全性评价提供了更接近人体生理的体外工具。

　　

研究背景与意义
药物开发过程中，因代谢酶介导的毒性导致研发失败或撤市的情况屡见不鲜。肠道作为药物吸收和代谢的重要场所，其屏障功能受代谢酶活性直接影响。传统Caco-2细胞虽广泛用于肠屏障研究，但其代谢酶谱与人类肠道存在显著差异：CES1表达过高而CYP3A4（细胞色素P450 3A4）和UGT1A1（尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1）表达不足，可能导致药物毒性评估偏差。例如，抗癌药伊立替康（CPT-11）需经CES水解为活性代谢物SN-38，后者又依赖UGT1A1解毒，传统模型难以模拟这一过程。

为解决这一问题，日本研究人员通过基因编辑技术构建了CES1敲除且可诱导表达CYP3A4/UGT1A1的Caco-2细胞系（CES1-KO/CYP3A4-UGT1A1-Caco-2），旨在建立更接近人类肠道的体外模型，精确评估药物代谢对屏障功能的调控机制。

关键技术方法
研究采用四组细胞模型：野生型Caco-2、CYP3A4诱导表达型、CES1敲除/CYP3A4共表达型、CES1敲除/CYP3A4/UGT1A1三基因修饰型。通过多西环素（Dox）诱导CYP3A4表达，利用跨膜电阻（TEER）和荧光标记大分子渗透实验评估肠屏障完整性，结合细胞活力检测分析CPT-11及SN-38的毒性效应。

研究结果

1. CYP3A4表达对CPT-11毒性的影响
   CYP3A4-Caco-2细胞中，CPT-11经CYP3A4代谢为无活性产物，毒性未显著改变，但CES1的存在导致SN-38生成增加，加剧屏障破坏（TEER值下降40%）。

2. CES1敲除的调控作用
   CES1敲除后，CPT-11的毒性降低（细胞存活率从75%升至87%），屏障功能损伤减轻，证实CES1高表达会夸大CPT-11的肠道生物转化毒性。

3. UGT1A1的解毒效应
   在CES1-KO/CYP3A4-UGT1A1-Caco-2细胞中，SN-38被UGT1A1葡萄糖醛酸化，其细胞毒性降低50%，屏障渗透性改善（大分子渗透量减少60%），模拟了人类肠道的解毒途径。

结论与意义
该研究首次系统验证了基因工程Caco-2细胞在药物肠屏障毒性评估中的优势：CES1敲除避免了CPT-11代谢高估，CYP3A4/UGT1A1共表达精准模拟了人类肠道代谢网络。这一模型为预测药物及外源物的肠道毒性提供了更可靠的平台，尤其适用于代谢酶依赖性药物的安全性评价，填补了传统模型与人体生理差异的技术空白。研究成果发表于《Toxicology Letters》，为药物开发中的代谢毒性预警提供了新工具。