苏云金芽孢杆菌Cyt2Aa2在脂膜上的寡聚组装揭示其线状结构及其杀虫机制

本研究针对苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫蛋白Cyt2Aa2的作用机制不明确问题，通过原子力显微镜(AFM)和透射电镜(TEM)技术，解析了Cyt2Aa2在合成脂膜和红细胞膜上的寡聚组装结构。研究发现，Cyt2Aa2在POPC膜上形成螺旋面状(fusilli-like)结构，而在POPC/胆固醇膜上形成环状结构，并在红细胞中观察到线状寡聚体及纳米孔。该成果为阐明Cyt蛋白的膜作用机制提供了直接结构证据，对开发新型生物杀虫剂具有重要意义。

　　

在生物防治领域，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)因其产生的杀虫蛋白而被誉为"天然杀虫剂"。其中，细胞溶素(Cyt)蛋白家族以其独特的直接作用于细胞膜的特性备受关注。然而，尽管Cyt蛋白的杀虫活性已被证实数十年，其精确的分子机制仍存在争议——究竟是形成跨膜孔道还是通过类似去垢剂的作用破坏膜结构？这一科学问题的解答，对于开发新一代高效、特异的生物农药至关重要。

针对这一关键问题，来自泰国Burapha大学和奥地利维也纳自然资源与生命科学大学的研究团队，选择Cyt2Aa2蛋白作为研究对象，通过多尺度成像技术揭示了其在脂膜上的动态组装过程。这项发表在《Toxicon: X》的研究，首次捕捉到Cyt2Aa2在不同脂质环境中形成的特征性超分子结构，为理解其杀虫机制提供了直观的结构生物学证据。

研究人员采用三项核心技术方法开展研究：(1)通过SDS-PAGE分析蛋白梯带模式验证Cyt2Aa2与脂膜的相互作用；(2)利用原子力显微镜(AFM)在纳米尺度解析Cyt2Aa2在合成脂膜(POPC、POPC/胆固醇)上的表面拓扑结构；(3)结合透射电镜(TEM)观察Cyt2Aa2在红细胞膜上的寡聚体形态。所有实验均在25°C标准条件下进行，红细胞样本来源于商业化的绵羊血液。

研究结果部分呈现了四个关键发现：

3.1 Cyt2Aa2在脂质体上的组装呈现蛋白梯带模式
SDS-PAGE分析显示，Cyt2Aa2能与不饱和磷脂POPC及其与胆固醇的复合膜结合形成特征性梯带，但不能与饱和磷脂DPPC结合。这种梯带模式与溶血活性直接相关，提示其可能代表功能性寡聚体的解离形式。

3.2 蛋白梯带与溶血活性的关联
免疫印迹证实，只有经胰凝乳蛋白酶激活的Cyt2Aa2才能与红细胞膜结合并引发溶血。在低浓度(3.2 μg/ml)时，不完全溶血现象表明Cyt2Aa2需要达到临界浓度才能在膜上形成功能性寡聚体。

3.3 Cyt2Aa2在脂膜上的寡聚组装
AFM成像揭示了脂质组成决定组装形态：在纯POPC膜上形成高度约3 nm的螺旋面状结构，而在POPC/胆固醇(1:1)膜上则组装成直径100 nm、高1.5 nm的环状结构。这种差异暗示胆固醇可能诱导Cyt2Aa2发生构象变化，使其部分插入膜中。

3.4 红细胞膜上Cyt2Aa2寡聚体结构
TEM显示Cyt2Aa2在红细胞膜表面形成连续覆盖层，并在膜破裂边缘可见明显的蛋白沉积。经Triton X-100提取的寡聚体呈现长度可达100 nm的线状结构，其中嵌有直径约20 nm的纳米孔，这可能是导致细胞渗透压失衡的关键结构。

在讨论部分，研究团队提出了创新的作用机制模型：在流体相膜(如POPC)中，Cyt2Aa2通过表面聚集形成螺旋面状寡聚体，机械性破坏膜完整性；而在富含胆固醇的膜区，蛋白分子部分插入脂双层，通过纳米孔连接形成环状结构，引发渗透性溶解。这种双模式作用机制解释了Cyt蛋白广谱活性的结构基础。

该研究的突破性发现在于首次通过高分辨率成像技术捕获了Cyt蛋白的动态组装过程。特别是纳米孔结构的发现，为经典的"孔形成理论"提供了直接证据；而不同脂质环境诱导的形态差异，则揭示了Cyt蛋白环境敏感性的分子基础。这些发现不仅解决了长期存在的机制争议，还为设计针对特定害虫膜组成的工程化Cyt蛋白提供了理论指导。未来研究可进一步聚焦昆虫靶细胞膜的特定脂质组成，以开发更具特异性的生物杀虫剂。