色差校正冷冻电镜技术揭示伪狂犬病毒结构：零损失与能量损失电子的协同成像突破

本研究针对冷冻电镜(Cryo-EM)成像中色差(Cc)导致厚生物样品信号丢失的难题，首次采用色差校正冷冻电镜结合电子能量损失谱技术，成功解析了伪狂犬病毒(PRV)的4.9?分辨率结构。研究发现能量损失电子(18-28 eV)携带相反的振幅对比度信号，通过Cc校正可恢复其相位信息，为原位冷冻电镜研究厚样品(100-500 nm)提供了新思路。

　　

在结构生物学领域，冷冻电镜(cryo-EM)技术已成为解析生物大分子结构的利器。然而传统电镜存在一个长期困扰研究者的"阿喀琉斯之踵"——色差(chromatic aberration, Cc)。当电子束穿透样品时，部分电子会与样品发生非弹性碰撞损失能量(1-100 eV)，这些"走神"的电子因能量差异在传统电镜中无法被准确聚焦，导致图像模糊。这个问题在厚样品(如完整细胞或大病毒颗粒)成像时尤为突出，因为样品越厚，产生非弹性散射电子的比例越高。据统计，在70°倾转的样品中，非弹性散射电子占比可达45%，这些携带结构信息的电子却被传统电镜"拒之门外"。

南方科技大学冷冻电镜中心的研究团队在《Ultramicroscopy》发表的研究，犹如给电镜装上了"近视矫正镜"。他们采用全球首台色差校正冷冻电镜，结合电子能量损失谱技术，以伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)为模型，首次实现了同时利用弹性散射(零损失)和非弹性散射(能量损失)电子的协同成像。这项研究不仅将PRV的分辨率提升至4.9?，更开创性地证明：那些被传统电镜抛弃的"迷途电子"，经过适当矫正后，同样能携带宝贵的结构信息。

研究采用了两套电镜系统：配备Selectris能量滤波器和Falcon 4探测器的Cc/Cs校正Titan Krios G4，以及传统Cs校正的Titan Krios G3i。通过精确控制能量过滤窗口(零损失ΔE=0 eV，低损失ΔE=23 eV)，研究人员在同一区域先后采集零损失和低损失电子图像。利用单颗粒分析技术，通过MotionCorr2运动校正、CTFFIND4对比传递函数估算，以及Relion 4.0三维重构等流程，最终获得了包含17,536个低损失电子颗粒的数据集。

研究结果揭示了三个重要发现：

1. 色差校正效果验证：通过金/碳光栅的杨氏双缝实验证实，Cc校正后信息极限延伸至1?。测量显示Cc校正电镜的离焦漂移仅为-1.5±5.3 nm，而传统电镜高达-292±20 nm，证明Cc校正有效消除了能量偏移引起的离焦扩散。

2. 振幅对比反转现象：零损失电子图像中病毒呈现暗背景亮颗粒，而低损失电子图像则完全相反。功率谱分析发现低损失电子的第一极小值出现在零损失电子的右侧，证实其具有相反的振幅对比特性。通过优化重建参数，发现低损失电子的最佳振幅对比值约为0.03。

3. 离焦依赖性分辨率：将低损失数据集按不同离焦范围分组后发现，3500-7000?离焦范围内的重建分辨率最佳(9.5?)。Rosenthal-Henderson图显示Cc校正弹性重建的B因子最低(78±3?²
   )，而非Cc校正的低损失重建B因子最高，证实Cc校正能显著提升信号质量。

在讨论部分，研究者指出这项技术的突破性在于：首次证明经过适当校正后，非弹性散射电子(18-28 eV)携带的结构信息可被有效提取。虽然这些电子具有相反的振幅对比和更快的信号衰减(B因子225±12?²
)，但其相位信息对厚样品成像具有重要补充价值。特别值得注意的是，低损失电子的信息恢复具有明显的离焦依赖性——离焦值越小，信号保留越完整。这为未来将Cc校正与相位板技术结合，实现近聚焦成像提供了理论依据。

这项研究的意义不仅在于技术突破，更开辟了冷冻电镜应用的新维度。对于日益兴起的原位结构生物学研究，当样品厚度超过100nm时，Cc校正技术可使总信号强度提升约12%。研究者预言，结合无损失相位板技术，未来有望实现对细胞原位蛋白质机器的"全景式"解析，为生命科学研究提供更接近自然状态的分子影像。