基于半抗原免疫亲和垂钓技术鉴定AIF1为三七皂苷在脑出血小鼠脑组织中的蛋白靶点

针对脑出血(ICH)治疗靶点不明的问题，南京中医药大学团队通过半抗原免疫亲和垂钓(HIAF)技术结合LC-MS分析，首次发现移植炎症因子1(AIF1)是三七皂苷代谢物Compound K(CK)的关键作用靶点，BLI动力学分析显示其亲和力达4.33±0.17E-6 M，分子对接揭示L122/E125为关键结合位点，为开发靶向微胶质细胞激活的ICH治疗策略提供新依据。

　　

脑出血（Intracerebral hemorrhage, ICH）作为致死致残率最高的卒中类型，五年生存率不足50%，幸存者中80%丧失独立生活能力。尽管三七（Panax notoginseng, PN）及其活性成分三七皂苷（PNS）在改善脑出血方面显示出明确疗效，但其具体作用靶点始终是未解之谜。这一科学问题的破解不仅关乎传统中药现代化，更为开发精准治疗策略提供关键突破口。

南京中医药大学研究团队在《Journal of Ginseng Research》发表的研究中，创新性地建立了液相色谱-质谱联用（LC-MS）为基础的半抗原免疫亲和垂钓（Hapten Immunoaffinity Fishing, HIAF）技术体系。通过免疫大鼠获得广谱识别三七皂苷的多克隆抗体，结合ICH小鼠脑组织样本，成功捕获7个差异蛋白。与疾病靶点数据库交叉验证后，锁定移植炎症因子1（Allograft Inflammatory Factor 1, AIF1）——这个已知的微胶质细胞激活标志物作为关键靶标。

研究采用三大关键技术：1）HIAF技术构建（以Rh1-mcKLH偶联物免疫动物获得抗体）；2）生物层干涉仪（Biolayer Interferometry, BLI）实时检测分子互作；3）分子对接与定点突变验证结合位点。通过系统性实验，首次揭示了三七皂苷代谢物Compound K（CK）与AIF1的特异性结合机制。

3.1 初步筛选ICH小鼠脑组织中三七皂苷的蛋白靶点
通过HIAF技术从脑组织裂解液中钓取7个差异表达蛋白，与ICH/脑缺血疾病靶点数据库交集分析，发现AIF1是唯一重叠蛋白。火山图显示AIF1在给药组显著富集，提示其可能介导三七皂苷的神经保护作用。

3.2 CK与AIF1直接结合
BLI检测显示，11种三七皂苷及其代谢物中，CK与AIF1结合最强（平均位移值0.1091 nm）。动力学分析测得亲和力K_D
=4.33±0.17×10^-6
M，证实二者存在高亲和力相互作用。

3.3 AIF1与CK的分子对接
基于小鼠AIF1晶体结构（PDB 1WY9）的模拟显示，CK通过氢键与K53、L122、E125氨基酸结合，其中糖基与L122/E125形成稳定相互作用，对接评分支持该结合模式。

3.4 L122和E125残基是互作关键位点
定点突变实验证实：L122P突变使亲和力下降26倍（K_D
=1.13×10^-4
M），E125A突变导致结合完全丧失，而K53A仅引起6倍降低，表明L122/E125构成的结合口袋对CK识别至关重要。

3.5 生物信息学分析
STRING数据库分析AIF1互作网络，GO富集显示"微胶质细胞激活"（GO:0001774）是最显著生物过程，提示三七皂苷可能通过调控AIF1介导的神经免疫反应改善ICH病理。

这项研究具有双重突破性：方法学上创建的HIAF技术为天然小分子靶标筛选提供新范式；生物学意义上首次揭示AIF1是三七皂苷改善ICH的潜在靶点，特别是代谢产物CK通过L122/E125位点的高亲和结合，可能调控微胶质细胞功能。尽管存在未完全覆盖皂苷结构多样性的局限，但为开发靶向AIF1的ICH治疗药物奠定基础，也为阐释"活血化瘀"中药的现代科学内涵提供关键证据。未来研究需进一步验证AIF1-CK互作对微胶质细胞极化的调控机制，推动传统中药向精准医学转化。