基于MVA疫苗交叉免疫原性抗原L1和A33的猴痘病毒定量检测IC-ELISA方法开发及验证

为解决MVA疫苗效价评估依赖动物实验的局限性，上海生物制品研究所团队开发了两种靶向猴痘病毒交叉免疫原性抗原L1和A33的间接竞争ELISA（IC-ELISA）方法。研究证实M1-IC-ELISA（线性范围31.25-2000 ng/mL）和A35-IC-ELISA（线性范围3.90-1000 ng/mL）具有高特异性，与病毒滴度、中和抗体效价显著相关，为疫苗质量控制提供了符合3Rs原则的体外替代方案。

　　

猴痘疫情在2022年全球爆发后持续引发公共卫生危机，世界卫生组织于2024年再次将其列为国际关注的突发公共卫生事件。虽然以改良痘苗病毒安卡拉株（Modified Vaccinia Virus Ankara, MVA）为基础的JYNNEOS疫苗展现出良好安全性，但传统疫苗效价评估仍依赖动物实验，存在周期长、变异大等缺陷。如何建立符合3Rs原则（减少、优化、替代动物实验）的体外检测方法，成为疫苗质量控制领域的关键挑战。

上海生物制品研究所的研究团队瞄准这一科学问题，针对MVA疫苗中与猴痘病毒具有交叉免疫原性的两种关键抗原——来自细胞内成熟病毒颗粒（Intracellular Mature Virion, IMV）的L1蛋白（对应MPXV M1）和细胞外包膜病毒颗粒（Extracellular Enveloped Virion, EEV）的A33蛋白（对应MPXV A35），开发了高灵敏度定量检测方法。这项发表在《Journal of Virological Methods》的研究，为疫苗质量控制的标准化提供了创新解决方案。

研究团队采用单克隆抗体开发技术，首先在Expi293F细胞中表达重组MPXV M1和A35蛋白，免疫小鼠后获得高特异性单克隆抗体。基于这些抗体，建立了两种间接竞争ELISA（Indirect Competitive ELISA, IC-ELISA）检测体系：M1-IC-ELISA检测L1蛋白的线性范围为31.25-2000 ng/mL，检测限（Limit of Detection, LOD）为48.36 ng/mL；A35-IC-ELISA检测A33蛋白的线性范围达3.90-1000 ng/mL，LOD低至3.74 ng/mL。方法学验证显示两种方法均符合国际生物分析标准，批间变异系数小于15%，回收率稳定在85%-115%之间。

细胞和病毒
研究使用SP2/0、BHK-21和CEF细胞培养系统，从ATCC获取的MVA病毒株（VR-1508）作为抗原来源，确保实验材料的标准化。

抗体制备与表征
通过Ni-NTA树脂纯化获得高纯度M1（22 kDa）和A35（16 kDa）蛋白，免疫小鼠产生的单克隆抗体经表面等离子共振（SPR）验证，对各自靶标具有nM级亲和力，且与MVA疫苗中L1/A33蛋白呈现特异性结合。

方法学建立与验证
建立的IC-ELISA采用竞争抑制原理，标准曲线R²

0.99。交叉反应实验证实抗体对其它痘病毒蛋白无显著结合，加速稳定性试验显示试剂在37°C保存7天后活性保持>90%。

疫苗样品分析
在3批MVA疫苗成品检测中，L1和A33含量与病毒滴度（Spearman r=0.89）、MPXV交叉抗体效价（r=0.92）及MVA中和抗体效价（r=0.85）均呈显著正相关，证实抗原含量可预测免疫原性。

讨论与结论
该研究首次实现MVA疫苗中IMV和EEV双组分抗原的同步定量，突破传统动物实验仅能评估整体效价的局限。特别值得注意的是，A35-IC-ELISA对A33的检测灵敏度达到3.74 ng/mL，能满足低剂量疫苗（如皮内接种制剂）的质量监控需求。研究数据支持将L1/A33含量作为关键质量属性（Critical Quality Attribute, CQA），为WHO倡导的疫苗体外效力检测替代方法提供实证依据。

作者Linya Zhang、Mingchan Liang等强调，这种方法不仅能大幅缩短疫苗质控周期（从数周缩短至2天），更可减少90%以上的实验动物使用。随着MVA疫苗进入临床试验阶段，这种基于抗原定量的策略有望成为国际疫苗监管协调的新标准，对应对当前猴痘疫情和未来潜在痘病毒威胁具有重要战略意义。