蓝移通道视紫红质KnChR的冷冻电镜结构解析与光遗传学应用创新

本研究针对多色光遗传学中蓝光激活工具匮乏的难题，通过冷冻电镜技术解析了丝状藻Klebsormidium nitens来源的蓝移通道视紫红质(KnChR)的2.7?高分辨率结构。研究首次揭示6-s-cis构型视网膜发色团的光谱蓝移机制，阐明C端结构域调控通道动力学的变构原理，并成功开发出λmax =420 nm的突变体KnChortRQ。该成果为开发紫外-深蓝光敏感工具、减少与红光工具RCaMP的交叉干扰提供了新范式，发表于《Nature Communications》。

　　

在神经科学领域，光遗传学技术通过光敏蛋白实现对神经环路的精准操控，其中多色光遗传学需要光谱分离的激活工具。然而现有蓝光敏感通道视紫红质(ChR)存在两大瓶颈：一是激活波长与红光工具如ChrimsonR(λ_max
≈590 nm)光谱重叠导致交叉干扰，二是蓝光敏感ChR的λ_max
多集中在470 nm附近，难以与575 nm激发的钙探针R-GECO兼容。更严峻的是，当蓝光工具表达量不足时，405 nm激发的效率低下会严重影响实验信噪比。

日本东京大学等机构的研究团队将目光投向自然界已知最蓝移的ChR——源自丝状藻Klebsormidium nitens的KnChR(λ_max
=430/460 nm)。通过冷冻电镜解析其2.7?结构，发现独特的6-s-cis视网膜构型导致β-紫罗兰酮环140°旋转，使π共轭体系收缩产生蓝移。更令人振奋的是，基于结构指导开发的KnChortRQ突变体将λ_max
进一步推至420 nm，紫外光(385 nm)激活效率达70%，为多色光遗传学提供了迄今最理想的蓝光工具。该成果发表于《Nature Communications》。

关键技术包括：1) 昆虫细胞表达系统制备KnChR-697蛋白；2) MSP2N2纳米盘重构解决冷冻电镜取向偏好问题；3) 300 kV Titan Krios显微镜采集8,554组数据；4) 全细胞膜片钳记录动作光谱；5) 大鼠皮层神经元验证光遗传学效用。

【结构解析】
冷冻电镜结构显示KnChR二聚体形成典型的7次跨膜拓扑，但N端呈现延伸构象并通过组氨酸簇(H37/H38/H41/H99)与谷氨酸(E39/E42/E240)形成静电网络。最具突破性的发现是视网膜发色团呈现6-s-cis构型，C17甲基与A161的空间位阻迫使β-紫罗兰酮环旋转，该构型通过A157T/A161G双突变验证——突变体λ_max
红移20 nm至470 nm。

【离子通路特征】
与CrChR2相比，KnChR的胞外区缺乏Q117介导的EV1/EV2分隔，形成单一腔室。关键残基E94与Y239形成氢键网络，其突变显著延缓通道关闭动力学(τ_off
)。中央约束位点(CCS)中D250作为反离子稳定视网膜希夫碱(RSB)，而E87Q突变延缓RSB再质子化过程。

【C端变构调控】
R287通过两种构象与E196/D200形成盐桥，其突变使τ_off
从25 ms延长至160 ms。R291则与膜脂POPC的酯基相互作用，揭示C端通过"膜锚定-变构传递"双重机制调控门控。

【蓝移工程】
基于结构设计A157G突变体(KnChortRG)使λ_max
蓝移至440 nm；更关键的I129Q突变(KnChortRQ)通过极性相互作用将λ_max
推至420 nm，在385 nm激发下仍保持70%的神经元激活效率，且与550 nm以上光探针完全无交叉。

这项研究不仅阐明6-s-cis构型的光谱调控机制，更开发出目前最蓝移的ChR工具。KnChortRQ的紫外-蓝光响应特性解决了多色光遗传学中光谱串扰的核心难题，其结构框架为理性设计光谱可调工具提供了新范式。值得注意的是，C端域变构调控的发现拓展了对ChR门控机制的理解，而纳米盘重构策略为小分子量膜蛋白(60.8 kDa二聚体)的冷冻电镜研究树立了新标杆。这些突破将推动神经环路解析向更高时空精度迈进。