犬源间充质干细胞外泌体缓释技术通过阴离子交换色谱法分离并促进脊髓损伤修复

为解决脊髓损伤(SCI)后功能恢复难题，大阪都市大学团队开发了基于阴离子交换色谱(AEX)的犬间充质干细胞(MSC)外泌体(EV)高效分离技术，并创新性地采用阳离子化明胶水凝胶实现EVs缓释。研究表明该技术显著抑制炎症因子(IL-1β/IL-6)，减少大鼠SCI模型空洞形成，促进运动功能恢复(BBB评分提高50%)，为临床转化提供了可规模化的EV治疗方案。

　　

脊髓损伤是导致人类和犬类运动感觉功能障碍的重大疾病，传统手术减压和固定治疗失败后常导致永久性残疾。间充质干细胞(MSC)疗法虽展现出潜力，但细胞移植存在致瘤风险，而MSC分泌的外泌体(Extracellular Vesicles, EVs)因其携带生物活性物质且安全性高成为再生医学新星。然而EVs临床应用面临两大瓶颈：规模化分离技术缺乏（传统超速离心法效率低），以及体内递送后快速清除（静脉注射半衰期仅2分钟）。

大阪都市大学研究团队创新性地将阴离子交换色谱(Anion Exchange Chromatography, AEX)应用于犬MSC-EVs分离，利用EVs表面负电荷特性实现高效捕获。通过优化阳离子化明胶水凝胶交联度（低/中/高三种条件），筛选出中等交联水凝胶可实现EVs最佳缓释效果（74.8%捕获率，259.3 ng/mL释放量）。在脂多糖(LPS)刺激的BV-2小胶质细胞模型中，AEX分离的EVs显著降低炎症因子IL-1β和IL-6表达（p<0.05）。大鼠脊髓挫伤模型显示，水凝胶缓释EVs组28天后BBB运动评分达10分（对照组仅4分），损伤中心空洞形成率降低17.32%（p<0.05），且1mm头端区域空洞减少56%。

关键技术包括：1）血清培养基培养犬MSC后AEX分离EVs；2）动态光散射检测EVs粒径（100.2±18.5 nm）；3）CD63/CD9 ELISA和TSG101免疫印迹验证EVs纯度；4）热脱水交联法制备阳离子化明胶水凝胶；5）胶原酶降解实验评估EVs释放动力学；6）大鼠脊髓挫伤模型（200 kdyne冲击力）和BBB运动功能评分。

研究结果部分：
3.1 AEX高效分离犬MSC-EVs：银染显示洗脱组分E3-5蛋白谱明显区别于培养上清，富含CD63（超CD9 3倍）、CD9和TSG101标志物。
3.2 EVs抗炎作用：10μg EVs使LPS刺激的BV-2细胞IL-6表达降低2.3倍（p<0.01）。
3.3 水凝胶缓释特性：中等交联水凝胶EVs捕获率74.8%显著高于低交联组（p<0.05），释放量是高交联组的2.6倍（p<0.001）。
3.4 运动功能恢复：EVs缓释组14天起BBB评分显著超越对照组（p<0.01），28天达协调性踏步水平。
3.5 空洞抑制：EVs组损伤中心空洞面积占比63.16%显著低于对照组80.48%（p<0.05）。

该研究首次建立犬MSC-EVs的AEX规模化分离技术，突破传统超速离心限制。阳离子化明胶水凝胶缓释系统通过电荷相互作用实现EVs局部长效释放，有效覆盖脊髓损伤后2-10天的关键修复窗口期。值得注意的是，AEX分离的EVs呈现CD63优势表达特征，提示可能富集了特定外泌体亚群（exosomes）。研究为脊髓损伤提供了可临床转化的组合治疗方案：上游AEX技术满足GMP级EVs生产需求，下游水凝胶缓释解决靶向递送难题。未来需进一步阐明EVs调控M2型小胶质细胞极化的分子机制，以及CD63^high
EVs亚群的特定修复功能。论文发表于《Regenerative Therapy》，为跨物种（犬-人）EVs治疗转化奠定基础。