探究血管性血友病因子D4-C6结构域罕见突变对VWF功能的影响机制

本研究针对血管性血友病（VWD）致病突变谱中研究较少的VWF蛋白D4-C6结构域，通过定点诱变和HEK293T细胞表达系统，系统评估9种低频突变对VWF分泌、多聚化及细胞内存储的影响。研究发现Arg2379Cys等突变导致分泌缺陷和异常多聚体形成，首次揭示C端突变可通过剂量效应（纯合/杂合）产生不同表型，为VWD精准分型提供新依据。

　　

血管性血友病（Von Willebrand Disease, VWD）作为最常见的遗传性出血性疾病，其发病机制与Von Willebrand因子（VWF）的数量或功能缺陷密切相关。尽管目前已发现数百种VWD相关突变，但针对VWF蛋白C端D4-C6结构域突变的研究仍存在显著空白。这一区域不仅参与VWF多聚体的组装，还影响其与血小板和胶原的相互作用，但该区域突变如何干扰VWF功能尚缺乏系统研究。

为填补这一知识空白，研究人员在《Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis》发表的研究中，聚焦9个临床报道但未充分验证的D4-C6结构域低频突变。通过构建Gly2044Asp、Arg2379Cys等突变体，采用HEK293T细胞表达系统结合多聚体分析技术，首次揭示这些突变通过不同分子机制破坏VWF功能：Arg2379Cys突变导致分泌的VWF仅形成单体/二聚体；Ser2497Pro和Cys2639Tyr显著降低分泌效率；而其他突变则完全阻断分泌。更值得注意的是，当Arg2379Cys突变体与野生型VWF共表达时呈现剂量依赖性表型——纯合状态下表现为2A型VWD特征（多聚体缺失），杂合时则表现为1型VWD（数量减少），这一发现为临床VWD分型提供了新的分子诊断依据。

关键技术方法包括：定点诱变构建VWF突变体、HEK293T细胞转染与表达分析、免疫荧光检测假性韦贝尔-帕拉德小体形成、非还原性电泳评估多聚体分布模式，以及使用VWF-A2CK片段研究二聚化机制。

【结果】
背景：D4-C6结构域突变在VWD中研究不足，但该区域对VWF多聚化和功能至关重要。
目标：评估9个低频突变对VWF分泌、存储和多聚化的影响。
方法：突变体在HEK293T细胞中表达后，通过ELISA、Western blot和免疫荧光进行分析。
结果：

• 分泌缺陷：Arg2379Cys、Ser2497Pro和Cys2639Tyr分泌量降低50-70%，其余突变完全无法分泌
• 多聚体异常：所有突变体在细胞裂解物中均显示异常多聚体模式
• 细胞内存储：突变体均不能形成正常假性韦贝尔-帕拉德小体
• 救援实验：Gly2044Asp等4个突变可被野生型VWF部分挽救功能
• 二聚化机制：Arg2379Cys在A2CK片段中仅形成二聚体，揭示其影响C端二硫键形成

结论与意义：该研究首次系统阐明VWF C端突变通过破坏分泌、多聚化和细胞内存储导致VWD的分子机制，特别是发现Arg2379Cys的剂量依赖性表型转换现象，为理解VWD临床异质性提供了新视角。这些发现不仅完善了VWD突变谱数据库，更对临床诊断中区分1型与2A型VWD具有重要指导价值，为开发靶向C端结构域的治疗策略奠定理论基础。