基于RNA测序的蜕膜化基因表达研究中参考基因的筛选与验证

为解决蜕膜化研究中RT-qPCR数据标准化难题，上海第一妇婴保健院团队通过RNA-seq筛选出10个新候选参考基因，结合五种算法验证发现STAU1在体外诱导和生理性蜕膜化中表达最稳定。该研究为子宫内膜基因表达分析提供了可靠内参，成果发表于《Reproductive Biology》。

　　

在生殖医学领域，子宫内膜蜕膜化（decidualization）是胚胎成功植入的关键环节，这一复杂的生理过程涉及基质细胞（ESCs）向分泌型蜕膜细胞的转化。然而，当前研究面临一个基础性难题——用于基因表达分析的参考基因（reference genes）选择缺乏统一标准。传统内参如β-肌动蛋白（ACTB）在月经周期中表达波动显著，可能导致RT-qPCR（逆转录定量聚合酶链反应）数据失真。

上海第一妇婴保健院联合同济大学的研究团队在《Reproductive Biology》发表论文，通过整合RNA测序（RNA-seq）和多重算法验证，首次系统筛选出适用于蜕膜化研究的稳定参考基因。研究人员从21例子宫内膜和13例蜕膜组织中分离原代细胞，利用E₂
-MPA-cAMP（雌二醇-醋酸甲羟孕酮-环磷酸腺苷）体外诱导蜕膜化模型，结合公共数据库GSE160702数据集，筛选出表达差异最小的10个候选基因。

关键技术包括：1）基于RNA-seq的差异表达分析（|log₂
FC|<1）；2）五算法稳定性评估（geNorm/NormFinder/BestKeeper/ΔCt/RefFinder）；3）自然妊娠与人工诱导的小鼠模型验证。

研究结果显示：

1. RNA-seq引导的候选基因筛选：火山图分析发现STAU1（Staufen双链RNA结合蛋白1）和KLHL9（kelch样家族成员9）在ESCs与分化ESCs（DESCs）间表达最稳定（图1），而ACTB表达波动显著。

2. 引物特异性验证：所有候选基因扩增效率达90.5-107.5%，熔解曲线呈单峰（图2），符合MIQE（定量PCR实验最低信息）指南要求。

3. 算法稳定性排名：

   • 体外模型：STAU1在RefFinder综合排名第一（稳定性值1.57），KLHL9次之（2.55），而ACTB排名倒数第二（9.49）（表3）。
   • 生理模型：STAU1仍保持最优（1.68），TSC1（TSC复合体亚基1）位列第三（2.00）（表4）。

4. 动态表达验证：在0-9天蜕膜化进程中，STAU1的Ct值变异最小（图6），显著优于ACTB和ZNF623。

5. 功能基因标准化验证：以STAU1为内参时，蜕膜标志物IGFBP1和PRL在DESCs中的表达差异更显著（P<0.001）（图7）。

6. 跨物种保守性：小鼠模型中Stau1同样稳定，其作为内参时蜕膜标记物Prl8a2的表达差异更可靠（图8）。

讨论部分指出，该研究首次证实STAU1在人和小鼠蜕膜化过程中均具有卓越的稳定性。其生物学基础可能与STAU1作为RNA结合蛋白（RBP）的广谱功能有关，该蛋白参与细胞分化、凋亡等多个保守通路。相比传统内参，STAU1能更准确反映IGFBP1等关键基因的真实表达变化，这对研究复发性流产（RM）和胚胎植入失败（RIF）的分子机制具有重要意义。

局限性在于蜕膜样本来自不同个体，未来需匹配同一患者的子宫内膜-蜕膜配对样本。团队建议在条件允许时采用STAU1+KLHL9组合进行标准化，以进一步提升数据可靠性。这项研究为生殖医学领域提供了首个经过多维度验证的蜕膜化参考基因体系，为相关疾病的分子诊断和治疗靶点筛选奠定基础。