同源重组技术构建减毒牛分枝杆菌副结核亚种本地强毒株及其免疫保护机制研究

本研究针对副结核病(PTB)防控难题，通过同源重组技术敲除牛分枝杆菌副结核亚种(Map)毒力相关operon（mce4和lprG-p55），系统评估了减毒株Map6611_ΔlprG-p55在牛巨噬细胞和小鼠模型中的免疫保护效果。结果表明lprG-p55缺失可显著降低细菌毒力并诱导强效免疫应答，为开发新型减毒活疫苗提供了重要候选株，对解决当前商品化灭活疫苗保护力不足的行业痛点具有突破性意义。

　　

副结核病（Paratuberculosis, PTB）是由牛分枝杆菌副结核亚种（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, Map）引起的慢性消耗性疾病，每年给全球畜牧业造成数十亿美元损失。当前防控面临三大困境：现有灭活疫苗仅能减轻临床症状而无法阻断感染；诊断技术难以检测长达2-4年的亚临床期感染；Map基因组操作困难导致毒力机制研究滞后。阿根廷农业技术研究所（INTA）与国立科学技术研究委员会（CONICET）联合团队另辟蹊径，选择从本地分离的强毒株Map6611入手，通过靶向改造毒力相关基因探索新型疫苗开发路径。

研究采用同源重组技术构建了mce4和lprG-p55双operon缺失株，通过牛单核细胞源性巨噬细胞（bMDM）感染实验和小鼠模型，结合CFU计数、病理学分析和细胞因子检测等多项技术评估毒力变化。特别值得注意的是，实验所用Map6611野生型菌株来自阿根廷本土临床分离株，这对确保疫苗株的地域适应性具有重要意义。

【Bacterial strains and culture conditions】
研究以阿根廷本土分离的Map6611强毒株为母本，在Middlebrook 7H9培养基中培养缺失株。培养基中添加的2 mg/mL mycobactin J（分枝杆菌生长必需因子）和0.05% Tween 80（防止细菌聚集）等关键成分，为后续实验提供了标准化的细菌悬液。

【In-vitro Map bovine macrophage infection】
bMDM感染实验显示，Map6611_ΔlprG-p55在感染后8天的存活率较野生型下降80%（p<0.01），而Δmce4株存活率无显著差异。但意外发现Δmce4能显著提升TNF-α和IL-12等促炎因子水平，提示mce4可能通过调控免疫应答而非细菌存活来影响致病性。

【讨论】
研究首次揭示lprG-p55 operon是Map核心毒力决定簇：其编码的LprG脂蛋白参与细胞壁组装，P55外排泵调控代谢物运输，双缺失导致细菌在巨噬细胞内无法获取生存必需物质。更关键的是，ΔlprG-p55诱导的Th1型免疫应答谱与保护性免疫高度相关，这为理解减毒活疫苗的交叉保护机制提供了新视角。

该研究的突破性发现在于：传统认为减毒株需完全丧失致病性，但Map6611_ΔlprG-p55展现出"适度减毒"特性——既保证安全性又维持足够免疫原性。这种平衡使其成为极具转化潜力的疫苗候选株，尤其对解决南美地区Map流行株差异导致的疫苗保护力不足问题具有特殊价值。论文发表于《Research in Veterinary Science》的这项成果，为全球PTB防控提供了从基础研究到应用转化的完整范例。