三维小鼠胚胎模型在植入期胚胎致死性测试中的应用：与二维细胞培养及斑马鱼模型的比较研究

为解决发育与生殖毒性(DART)研究中动物实验的高需求问题，研究人员开展了基于3D小鼠胚胎模型(ESC/TSC/XENC)的植入期胚胎致死性测试研究。通过比较2D单层细胞培养和斑马鱼胚胎模型，证实3D胚胎模型能特异性识别7种已知阳性/阴性化合物的胚胎毒性，其代谢活性、形态学和基因表达等综合指标可有效预测化合物对植入期胚胎的影响。该研究为替代动物实验提供了新策略，相关成果发表于《Reproductive Toxicology》。

　　

在药物研发过程中，评估新化合物对生殖周期的影响是必经之路。然而，现行的发育与生殖毒性(DART)研究仍高度依赖动物实验，每项研究需消耗大量实验动物。国际人用药品注册技术协调会(ICH) S5(R3)指南虽允许使用替代方法评估植入后阶段的胚胎致死性，但对植入前/植入期(FEED阶段)的研究仍缺乏标准化替代方案。这一空白使得开发能够模拟早期胚胎发育的体外模型成为迫切需求。

针对这一挑战，国外研究团队在《Reproductive Toxicology》发表了一项创新研究。他们利用小鼠胚胎干细胞(ESC)、滋养层干细胞(TSC)和胚外内胚层干细胞(XENC)构建了三维(3D)胚胎模型，模拟植入期(E5.5)胚胎发育特征。通过系统比较该模型与二维(2D)单层细胞培养及斑马鱼胚胎的表现，研究人员首次证实了3D胚胎模型在检测胚胎致死性化合物方面的独特优势。

研究采用三项关键技术：1) 基于AggreWell800平台的3D胚胎组装技术，以特定比例(24 ESC:64 TSC:18 XENC)构建胚胎样结构；2) 跨模型平行测试，涵盖代谢活性(CellTiter-Glo^?
3D检测)、形态学(ImageJ分析)和基因表达(qPCR)多维度评估；3) 斑马鱼胚胎毒性测试(OECD 236标准)。测试化合物包括5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤等4种阳性物质和青霉素-G等3种阴性对照。

3.1 3D胚胎模型可识别对胚胎本身具有广泛毒性的化合物
研究发现，5-氟尿嘧啶在0.4 μM(LOAEC)即显著降低胚胎代谢活性，LC₅₀
为0.96 μM。形态学显示胚胎整体缩小但TSC区比例增加，与2D实验中ESC细胞更高敏感性(IC₅₀
=0.3 μM vs TSC=8.3 μM)相吻合。甲氨蝶呤同样引发剂量依赖性毒性(LC₂₀
=0.1 μM)，而斑马鱼胚胎对这两种化合物均不敏感(耐受浓度>200 μM)。

3.2 模型可特异性识别靶向胚外结构的化合物
天花粉蛋白(trichosanthin)虽未影响整体代谢活性，但在5 μg/mL时即通过基因表达分析(Gata4/Sox17下调)和形态测量(TSC区占比下降)显示出对胚外结构的特异性损伤，这与该化合物已知的滋养层靶向机制一致。

3.3 模型对非胚胎毒性物质保持特异性
50 mM D-甘露醇和2 mM青霉素-G均未干扰胚胎发育，而2D培养中青霉素-G意外促进ESC/XENC增殖，凸显3D模型更好的生理相关性。

3.4 阶段特异性毒性鉴别能力
青蒿素(artemisinin)虽在妊娠后期引发胚胎致死，但在植入期相关浓度(≤200 μM)下仅使XENC细胞敏感性升高，证实模型可区分发育阶段特异性毒性。

讨论部分强调，这项研究首次系统验证了3D胚胎模型在植入期毒性评估中的双重价值：通过整合多端点分析，既能检测广谱胚胎毒性(如抗代谢药物)，又能识别胚外结构特异性损伤(如天花粉蛋白)。相比斑马鱼胚胎的低敏感性和2D培养的假阳性风险，该模型展现出更接近体内反应的预测能力。

研究局限性包括测试化合物数量有限和胚胎大小异质性等问题，但作者指出，通过自动化培养与图像分析技术的结合，该模型有望成为标准化测试平台。未来与子宫内膜类器官的整合，将进一步提升其对植入过程评估的应用潜力，为遵循3R原则(替代、减少、优化动物实验)的DART评估提供新范式。