犬口腔上皮细胞作为生物标志物在颊黏膜微核细胞组学检测中的应用与损伤评估研究

本研究针对犬类作为环境毒性暴露生物标志物的需求，通过组织学表征和BMCyt（Buccal Micronucleus Cytome assay）检测技术，首次系统描述犬颊黏膜上皮的角化特征，发现成年犬微核频率显著高于幼犬（6倍），并证实驱虫药哌嗪可诱导幼犬核溶解细胞倍增。该研究为利用犬类作为环境基因组损伤哨兵提供了标准化方法学基础。

　　

在城市化进程加速的今天，环境污染物对生物体的遗传毒性效应日益受到关注。犬类因其与人类共享生活环境、代谢相似性以及较短的寿命周期，成为理想的生物哨兵（sentinel species）。然而，如何准确评估这些动物暴露于环境毒物后的基因组损伤，一直是研究难点。传统方法如彗星试验（comet assay）操作复杂，而颊黏膜微核细胞组学检测（Buccal Micronucleus Cytome assay, BMCyt）虽在人类研究中成熟，却缺乏对犬类口腔上皮组织学特性的系统认知。更棘手的是，犬类口腔黏膜的角化程度可能影响细胞核的保留率，若误判正常角化过程为毒性损伤，将导致数据误读。

针对这一系列问题，胡安·奥古斯丁·马萨大学的研究团队在《Research in Veterinary Science》发表了一项开创性研究。该工作首次通过组织学与细胞组学双重视角，揭示犬颊黏膜上皮的角化特征与年龄、毒物暴露的关联规律。研究发现，健康犬的颊黏膜呈现独特的副角化分层（stratified parakeratinized）结构，这种介于角化与非角化之间的过渡状态，使得表层细胞仍保留细胞核——这正是BMCyt检测的关键前提。通过对36只纯种犬（幼犬与成年犬各半）的对比分析，研究人员捕捉到年龄对基因组损伤的累积效应：成年犬的微核（micronuclei）频率是幼犬的6倍，染色质凝聚细胞比例也翻倍。更引人注目的是，使用常见驱虫药哌嗪（piperazine）的幼犬群体中，核溶解细胞（karyolytic cells）数量在给药19天后显著增加，这一发现首次证明BMCyt可灵敏捕捉外源化合物对犬类基因组的干扰。

研究采用三项关键技术：组织学切片分析（确定采样区上皮特性）、BMCyt标准化流程（含机械刮取与双染色方案）、以及德国牧羊犬队列的Feulgen-Giemsa序贯染色对比实验。样本队列包含实验前/后配对设计的驱虫药暴露组，以及自然年龄分层的对照群体。

组织学研究结果
通过第三前臼齿至第一上臼齿区域的黏膜切片观察，发现犬颊上皮以副角化分层鳞状上皮为主，局部存在完全角化区域。基底层的多边形大核细胞、棘层的圆形细胞、颗粒层的扁平细胞以及角质层的无核细胞构成典型四层结构。这种混合角化模式提示采样时需避开完全角化区域，确保获取有效核物质。

BMCyt检测结果
成年犬微核频率达幼犬6倍（p < 0.05），印证年龄相关的基因组损伤累积假说。哌嗪暴露组幼犬的核溶解细胞比例倍增（p < 0.05），表明该化合物可能干扰细胞周期调控。序贯染色实验显示，Giemsa虽成本低廉但易漏检细微核异常，而Feulgen能精准显示DNA损伤模式，二者互补使用可优化检测效率。

讨论与意义
该研究首次建立犬BMCyt检测的组织学标准，其关于副角化上皮的发现纠正了既往文献中"非角化"的笼统描述。年龄分层数据为区分自然损伤与外源毒性提供了基线参考，而哌嗪诱导的核溶解效应警示需重新评估该药物的潜在遗传风险。方法论上，Feulgen-Giemsa序贯染色方案兼顾精度与成本，尤其适合大规模环境监测。

正如通讯作者Nora Bibiana Maria Gorla强调，这项成果不仅为犬类环境基因组学研究铺平道路，更通过"犬-人"暴露关联模型，为预测人类环境健康风险提供新工具。未来研究可进一步拓展至不同犬种的口腔上皮异质性分析，以及重金属、农药等污染物的特异性损伤标记开发。