鹅星状病毒基因1型和2型双重实时荧光RT-qPCR检测技术的开发与应用

本研究针对鹅星状病毒（GAstV）感染导致雏鹅痛风难以分型诊断的问题，开发了基于ORF1b基因的双重实时荧光RT-qPCR检测技术。通过优化引物探针体系和反应条件，实现了对GAstV-1和GAstV-2的高特异性（无交叉反应）、高灵敏度（102 拷贝/反应）检测，临床样本验证显示其可有效鉴别混合感染（15.38%共存率），为GAstV流行病学监测和精准防控提供了关键技术支撑。

　　

鹅星状病毒（GAstV）近年来已成为威胁养鹅业的"隐形杀手"。这种无包膜的单链RNA病毒能引发雏鹅内脏和关节尿酸盐沉积，导致高达80%的发病率和50%的死亡率。更棘手的是，该病毒存在GAstV-1和GAstV-2两种基因型，二者基因组同源性不足60%，且常出现混合感染，传统检测方法难以区分。尽管已有基于ORF1a和ORF2的单重检测技术，但针对高度保守的ORF1b（编码RNA依赖的RNA聚合酶RdRp）基因的双重分型检测仍是空白。

河北农业大学预防兽医学实验室的研究团队在《Research in Veterinary Science》发表的研究中，开发了一种突破性的双重实时荧光RT-qPCR检测技术。研究采用体外转录RNA构建标准曲线，通过梯度稀释法确定检测限，并选取104份临床肝脏样本进行验证。关键技术包括：TaqMan探针设计、反应体系优化（最佳引物浓度0.24-0.4 μmol/L）、退火温度梯度测试（58.2°C最佳），以及特异性验证（排除禽流感病毒H9等6种病原体干扰）。

【病毒和临床样本】收集GAstV-1（HeB-SJZ株）和GAstV-2（HeB-BD1株）毒株，以及104份表现痛风症状的雏鹅肝脏样本。

【双重RT-qPCR检测方法的优化结果】建立25 μL反应体系，采用Perfectstart?探针预混液，确定GAstV-1/GAstV-2最佳探针浓度比为1:0.6，扩增效率分别达96.06%和90.39%，R²
值均>0.998。

【讨论】该方法创新性地靶向ORF1b保守区，其检测灵敏度比常规RT-PCR高100倍，组内组间变异系数<3%。临床检测发现GAstV-2流行率（66.35%）显著高于GAstV-1（18.27%），提示需针对不同基因型制定差异化防控策略。

【结论】该研究建立的检测技术可实现单管同时鉴别GAstV基因型，为阐明病毒进化规律、开发基因型特异性疫苗提供了关键技术平台。研究获得"十四五"国家重点研发计划（2023YFD1802602）和河北省现代农业产业技术体系（HBCT2024260407/08）资助，Wenyang Liu等作者声明使用DeepSeek辅助语言润色但内容完全由作者负责。