基于DNA编码文库技术发现新型碳酸酐酶9抑制剂CA9–005及其抗肿瘤机制研究

本研究通过DNA编码文库(DEL)筛选技术，针对肿瘤关键靶点碳酸酐酶9(CA9)开展抑制剂发现研究，成功鉴定出高活性化合物CA9–005（IC50 =17.7μM），其通过独特结合模式抑制CA9活性并显著降低癌细胞活力，为开发选择性抗肿瘤药物提供了新策略。

　　

在肿瘤治疗领域，缺氧微环境驱动的肿瘤进展一直是重大挑战。碳酸酐酶家族成员CA9因其在调节肿瘤pH稳态中的核心作用，成为极具潜力的治疗靶点。尽管已有磺胺类CA9抑制剂报道，但存在选择性不足等问题。为此，研究人员采用革命性的DNA编码文库(DEL)技术，开展了大规模CA9抑制剂筛选工作。

研究团队首先构建了包含1000万化合物的DEL库，通过磁珠固定CA9蛋白进行亲和筛选，结合新一代测序(NGS)技术鉴定高结合力分子。关键实验技术包括：DEL筛选（含PCR扩增和NGS分析）、生物层干涉仪(BLI)验证结合力、酶活性抑制实验（测定IC₅₀
）、细胞毒性测试（SW620和MDA-MB-231细胞系）、以及计算模拟（结合自由能预测和结构对接）。

DEL筛选鉴定CA9结合分子
通过固定化CA9蛋白与DEL库的孵育，筛选出包含5-(氨甲基)吡啶甲酸(BB3–1)核心结构的优势化合物群。2D分析锁定CA9–005等6个候选分子，其C端经酯化修饰增强细胞活性。

酶抑制与结合特性分析
CA9–005展现最强抑制活性（IC₅₀
=17.7μM），而高亲和力的CA9–061/062（KD=335/74.6nM）抑制效果较弱。BLI揭示CA9–005的快速结合（k_on
=3.14M/s）与缓慢解离（k_off
=7.51×10^?7
s^?1
）特性，形成239nM的KD值。

结构机制解析
分子对接显示CA9–005的吲唑环与His-226形成π-π堆积，羧基与Asn-198/Gln-203产生极性作用。不同于磺胺类锌离子配位模式，CA9–005通过疏水相互作用占据催化裂隙，其预测结合能（ΔG=-8.72kcal/mol）与实验数据高度吻合。

抗肿瘤效果验证
在CA9高表达细胞中，CA9–005显著抑制细胞活力（SW620 IC₅₀
=205μM），而CA9–061/062效果微弱，证实酶抑制活性与抗癌效应的相关性。

该研究首次通过DEL技术发现非磺胺类CA9抑制剂，阐明CA9–005通过独特结合模式实现选择性抑制。尽管CA9–061/062展示更高亲和力，但其缺乏锌离子配位能力导致抑制失效，提示结合位点与催化位点的空间差异。研究成果为开发靶向肿瘤微环境的新一代CA9抑制剂奠定基础，同时彰显DEL技术在药物发现中的强大潜力。论文发表于《Results in Chemistry》，为克服现有CA9抑制剂的局限性提供了创新解决方案。