人工蜘蛛丝纳米纤维的冷冻电镜结构解析揭示β片层结晶机制

这篇研究通过冷冻电镜（cryo-EM）解析了人工蜘蛛丝蛋白（16× GDVIEV）纳米纤维的三种多态性原子结构，揭示了其通过液-液相分离（LLPS）形成β片层富集核心的机制。研究不仅阐明了氢键和疏水相互作用对纤维稳定的关键作用，还为仿生材料设计提供了新思路，突破了传统晶体结构对天然丝蛋白构象的认知局限。

　　

亮点

研究团队利用工程化的16× GDVIEV蛋白，通过液-液相分离（LLPS）形成富含β片层核心的纳米纤维。冷冻电镜技术揭示了三种纤维多态性结构，其稳定性依赖于氢键和疏水相互作用。值得注意的是，纤维核心的β片层排列方式与晶体结构存在显著差异，为天然蜘蛛丝中β片层的组织机制提供了新见解。

摘要

蜘蛛丝以其卓越的机械性能（如高强度、高韧性和轻量化）成为备受关注的生物材料。这些特性主要源于由多聚丙氨酸（poly(A)）序列构成的β片层结晶区域，其形成涉及液-液相分离（LLPS）。然而，纳米级尺寸和无序片段的存在使得结构表征极具挑战性。本研究聚焦一种人工蜘蛛丝蛋白，通过将poly(A)基序替换为促进β片层形成的淀粉样肽（GDVIEV），成功模拟了天然蜘蛛丝的LLPS和纳米纤维形成过程。冷冻电镜分析鉴定出三种不同的纤维多态性，其中GDVIEV肽在纳米纤维核心主要呈现β片层构象，通过氢键和疏水相互作用稳定。这些发现深化了对蜘蛛丝自组装机制和结构组织的理解，为仿生丝材料开发和人工蛋白设计提供了重要参考。

引言

蜘蛛丝，尤其是大壶腹腺分泌的主要壶腹丝（MaSp），是自然界最杰出的生物材料之一。其机械性能远超凯夫拉纤维和钢铁，引发了广泛研究。蜘蛛丝的高强度主要归因于高度有序的β片层结晶域，而弹性则源于无定形区域。尽管已有大量研究，但β片层结晶域的原子结构仍不明确。X射线衍射和固态核磁共振（NMR）研究表明，蜘蛛丝中存在复杂的多态性结构。

蜘蛛丝的形成是一个多阶段过程，涉及LLPS和液-固相变。在丝腺中，丝蛋白最初以溶液形式存在，随后通过LLPS浓缩，并在剪切力作用下最终形成高强度丝纤维。本研究通过人工蜘蛛丝蛋白（16× GDVIEV）模拟这一过程，揭示了纳米纤维的原子结构特征。

结果

相分离与纳米纤维形成

16× GDVIEV和16×重组丝蛋白在特定条件下发生LLPS，形成液滴并进一步转化为纳米纤维。原子力显微镜（AFM）和透射电镜（TEM）显示，16× GDVIEV纤维呈现三种不同的螺旋周期，半螺距分别为～36 nm、～67 nm和～108 nm。

冷冻电镜结构解析

通过冷冻电镜技术，团队成功解析了16× GDVIEV纳米纤维的三种多态性原子结构，分辨率达3.08–3.27 ?。多态性1呈现中心对称结构，多态性2和无序，多态性3则更为复杂。相比之下，16×重组丝蛋白纤维因缺乏螺旋对称性而未能获得高分辨率结构。

结构分析

三种多态性的核心均由GDVIEV肽段构成，但排列方式各异。多态性1中，四条肽链形成四股β链（β1–β4），通过疏水相互作用和氢键稳定；多态性2中，三条肽链形成三股β链（β1–β3）；多态性3则包含五股β链（β1–β5）。值得注意的是，纤维核心中GDVIEV的排列与晶体结构显著不同，表明晶体结构可能无法完全反映天然丝蛋白的真实构象。

讨论

人工蜘蛛丝蛋白的工程化设计为理解天然丝蛋白的结构-功能关系提供了模型系统。研究证实，β片层核心的多样性与蜘蛛丝的机械性能密切相关。此外，纤维多态性的存在提示了序列灵活性和分子间相互作用的复杂调控。尽管天然丝蛋白的结构解析仍面临挑战，本研究通过人工蛋白的原子结构解析，为未来探索天然丝蛋白的动态组装机制奠定了基础。

方法

蛋白质通过大肠杆菌表达系统纯化，荧光标记后用于LLPS实验。纳米纤维通过磷酸盐缓冲液孵育制备，并通过冷冻电镜、AFM和TEM表征。图像处理采用RELION v.3.1进行 helical reconstruction，原子模型通过COOT和PHENIX构建优化。

资源可用性

冷冻电镜密度图和原子模型已存入EMDB和PDB数据库（登录号：EMD-62658/62666/62779；PDB: 9KZB/9KZO/9L2S）。