综述：纳米孔技术推动蛋白质鉴定与测序的进展

这篇综述系统阐述了纳米孔（nanopore）技术在蛋白质组学中的革命性潜力，重点探讨了其在单分子水平实现蛋白质鉴定（identification）和从头测序（de novo sequencing）的最新进展。作者对比了全蛋白质检测（full-length fingerprinting）、片段分析（fragmentation）和运动控制（motion control）等策略，并指出工程化改进（如电渗流优化EOF、孔功能化）是突破现有技术瓶颈的关键。综述强调，该技术有望弥补质谱（MS）在灵敏度、动态范围和便携性上的不足，为疾病机制研究和精准诊断提供新工具。

　　

蛋白质分析的演变：纳米孔技术及其新兴角色

过去几十年，DNA测序和单细胞基因组学在分子水平上极大拓展了人们对细胞过程和疾病机制的理解。这种成功激发了在蛋白质分析领域实现类似突破的渴望，因为蛋白质是细胞内的主要功能单元。由于选择性RNA剪接和翻译后修饰（PTM）等步骤的存在，人类约2万个蛋白质编码基因可表达数百万种蛋白质变体（proteoforms）。质谱（MS）虽是蛋白质分析的金标准，但其灵敏度、检测限和读长限制促使单分子技术（如纳米孔传感）成为补充方案。

纳米孔蛋白质鉴定与测序的概念

蛋白质由20种化学性质各异的氨基酸组成，折叠成复杂三维结构，而PTM进一步增加了其调控复杂性。纳米孔技术可通过不同分析策略获取这些特性（见表1）。

全蛋白质鉴定

纳米孔能测量完整蛋白质分子（图1A）。折叠蛋白质需使用大孔（如PlyAB），而化学展开的蛋白质可通过窄孔（如α-溶血素a-HL）检测。例如，PlyAB能以>97%准确度区分天然血红蛋白中的单氨基酸替换。小孔（如a-HL）则需结合变性剂（如胍盐GdmCl）展开蛋白质，实现90%的区分准确度。

片段化测序

片段化策略（图1B）通过蛋白酶（如胰蛋白酶）将蛋白质分解为肽段。气溶素（aerolysin）孔可区分13种氨基酸突变，而功能化MspA孔通过金属离子介导的复合物实现了20种氨基酸的99.1%准确识别。但片段法因顺序丢失难以重建序列，且混合样本中应用受限。

运动控制测序

DNA马达（如Hel308）与MspA结合可实现肽段逐步转运（图1C左），而蛋白质马达（如ClpX）与CsgG孔联用可控制长链多肽以每次2个氨基酸的速度通过。最新研究通过“滑移序列”设计，将氨基酸识别准确率从28%提升至61%。

纳米孔蛋白质分析的工程策略

电渗流（EOF）优化

蛋白质电荷异质性阻碍电泳捕获，而EOF通过离子选择性产生独立于电荷的驱动力。例如，CytK突变体通过负电荷引入增强阳离子选择性，实现非电荷依赖性转运。

孔功能化

MspA孔通过半胱氨酸修饰和Ni²⁺
螯合，形成氨基酸识别位点（图2B）。单层二硫化钼（MoS₂
）孔因0.7 nm厚度可区分16种氨基酸，但灵敏度仍需提升。

分析物修饰

金刚烷标记可延长氨基酸在a-HL孔中的停留时间，而葫芦[7]脲（cucurbit[7]uril）通过主客体复合物增强苯丙氨酸信号。此类修饰虽增加样本制备复杂度，但能突出特定残基或PTM。

未来展望

纳米孔蛋白质测序仍需解决三个核心问题：1）运动控制系统的氨基酸识别灵敏度；2）蛋白质结构对信号的干扰；3）通用样本标记方法的开发。随着工程技术的进步，该技术有望成为继DNA测序后单分子分析领域的下一个里程碑。