增强蛋白质-RNA交联质谱技术的结构建模潜力：高灵敏度工作流程的开发与应用

本研究针对蛋白质-RNA相互作用的结构解析难题，开发了一种优化的CLIR-MS（交叉连接同位素标记RNA质谱）工作流程。通过改进样品制备、数据采集和解释方法，显著提高了交联产物的检测数量，首次提出了蛋白质-RNA交联距离的量化模型。该技术成功应用于四种典型和非典型RNA结合域复合物的结构研究，为整合/混合结构生物学提供了新的实验约束条件。

　　

在生命活动的核心舞台上，蛋白质与RNA的相互作用（protein-RNA interactions）扮演着举足轻重的角色。从基因表达的调控到病毒的复制，这些分子间的"对话"几乎参与了所有关键的生物学过程。然而，解析这些动态复合物的精细结构一直是个巨大挑战，特别是对于那些缺乏经典RNA结合域（non-canonical RNA-binding domains）的蛋白质。传统结构生物学技术如X射线晶体学和冷冻电镜虽然能提供高分辨率的结构信息，但对样品纯度、结晶性和构象均一性要求极高，且难以捕捉溶液状态下的动态相互作用。

正是在这样的背景下，来自苏黎世联邦理工学院等机构的研究团队在《Nucleic Acids Research》上发表了一项突破性研究。Chris P. Sarnowski、Anna Kn?rlein等研究人员针对现有蛋白质-RNA交联质谱（XL-MS）技术的两大核心局限——交联产物丰度低和结构约束信息不明确，开发了一套优化的CLIR-MS（cross-linking of isotope-labelled RNA coupled to mass spectrometry）工作流程。这项研究不仅显著提高了检测灵敏度，更重要的是首次系统量化了蛋白质-RNA交联所代表的距离约束，为这类重要生物分子的结构解析提供了新的工具。

研究团队采用了多项关键技术方法：1）优化的UV交联条件（254 nm或365 nm照射）；2）同位素标记RNA策略（¹³
C¹⁵
N全标记或¹³
C核糖标记）；3）金属氧化物亲和色谱（MOAC）富集；4）高分辨率质谱（Orbitrap Fusion Lumos）结合阶梯式HCD碎裂；5）扩展的xQuest搜索算法识别多种RNA衍生修饰；6）DisVis软件进行空间占据分析。研究对象包括FOX1、PTBP1、MBNL1等典型RNA结合蛋白与SF3A1泛素样结构域（UBL）等非典型RNA结合蛋白与其相应RNA的复合物。

优化CLIR-MS协议显著提升灵敏度

研究团队首先对CLIR-MS工作流程进行了系统性优化。通过改进样品制备（如使用STAGE tip代替传统固相萃取柱）和质谱采集参数（采用阶梯式HCD代替CID），PTBP1-IRES复合物的交联谱图匹配数（XLSMs）从117增加到401，独特交联产物从42增加到114种。这些优化被证明具有普适性，在FOX1-FBE复合物中也使XLSMs从约50/重复增加到200/重复。温度梯度实验（-20°C至37°C）和不同UV照射能量（150-400 mJ/cm²
）条件下的结果显示出良好的稳健性，交联位点分布基本不受实验条件变化影响。

全面表征交联产物拓展检测覆盖度

通过开放修饰搜索（MSFragger）和同位素配对验证，研究团队鉴定出10种新的RNA衍生肽段加合物类型（如-H₂
、-H₂
O、-HPO₃
等中性丢失产物）。将这些新产物纳入xQuest搜索后，FOX1-FBE数据的XLSMs从313激增至1171，独特交联位点组合从71增加到115种。这些新增交联位点与原有数据在蛋白质序列上的分布区域一致，增强了结果的可靠性。

多模型复合物的交联特征分析

研究将优化后的CLIR-MS应用于四类蛋白质-RNA复合物：1）FOX1 RRM结构域与FOX结合元件（FBE）RNA；2）MBNL1锌指结构域（ZnF）与CGCUU RNA；3）PTBP1 RNA识别基序（RRM）与UCUCU或IRES RNA；4）SF3A1 UBL结构域与U1 snRNA SL4。结果显示，交联位点均集中在已知的RNA结合区域：FOX1的F126和F160附近β片层表面；MBNL1 ZnF2的L69和ZnF4的F237周围；PTBP1各RRM的β片层表面；SF3A1 UBL的β1-β2环（Q715-K717）和β3-β4区域（E760-F763）。

量化蛋白质-RNA交联距离约束

通过将单核苷酸交联产物与已知结构比对，首次系统测量了蛋白质-RNA交联距离。结果显示，从氨基酸Cα到核苷酸N1（嘧啶）或N9（嘌呤）的平均距离为：FOX1（9.7 ?）、PTBP1（10.9 ?）、MBNL1（12.1 ?）和SF3A1（13.6 ?），显著短于随机组合的对照距离分布（P<0.001）。值得注意的是，ZnF介导的结合（MBNL1）比RRM介导的结合（FOX1和PTBP1）表现出稍长的交联距离，可能与氨基酸侧链长度差异有关。

CLIR-MS约束定义RNA空间占据

通过DisVis软件分析，仅使用CLIR-MS衍生的距离约束（Cα到N1/N9，0-12 ?）就能准确定位RNA在蛋白质表面的结合区域。对于具有刚性茎环结构的U1 snRNA SL4，交联数据还能指示RNA方向性——UUCG四环接触E760-F763区域，而茎部则锚定在Q715-K717附近。这种空间信息与后来解析的晶体结构高度一致，验证了CLIR-MS作为独立结构数据源的可靠性。

4-硫尿嘧啶交联的特性比较

研究还比较了4-硫尿嘧啶（4SU）与天然尿嘧啶的交联行为。虽然4SU使FOX1-FBE复合物的交联效率显著提高，但交联位点分布发生改变：天然尿嘧啶主要交联F160区域，而4SU则偏好N151附近。尽管两者平均交联距离相似（12.2 ? vs 9.7 ?），但DisVis分析显示4SU数据的空间约束性较弱，需要更多交联位点才能达到与天然碱基相当的空间分辨率。

这项研究代表了蛋白质-RNA相互作用结构解析方法学的重大进展。优化的CLIR-MS工作流程将检测灵敏度提高了3-4倍，而交联距离的量化则为这类数据在结构建模中的应用提供了关键参数。特别值得注意的是，该方法成功应用于非经典RNA结合域（如SF3A1 UBL）的研究，为日益增多的"非典型"RNA结合蛋白的结构功能研究