XPC-RAD23B与UV-DDB协同增强DNA损伤识别的新机制：核苷酸切除修复中病变搜索的分子基础

紫外线诱导的DNA损伤修复是维持基因组稳定的关键。本研究通过单分子成像和生化分析，揭示了XPC-RAD23B通过形成UX复合体增强UV-DDB与DNA结合的新机制，证明UV-DDB通过一维扩散(1D diffusion)搜索环丁烷嘧啶二聚体(CPD)，为全球基因组核苷酸切除修复(GG-NER)提供了全新见解。论文发表于《Nucleic Acids Research》。

　　

紫外线(UV)辐射会在DNA上形成环丁烷嘧啶二聚体(CPD)和(6-4)光产物(6-4PP)等损伤，这些损伤若不能及时修复将导致皮肤癌等疾病。在核苷酸切除修复(NER)途径中，全球基因组修复(GG-NER)负责识别和修复全基因组范围内的损伤，其中XPC-RAD23B复合物是关键起始因子。然而，CPD由于对DNA双螺旋结构破坏较小，XPC-RAD23B对其识别效率低下，需要UV-DDB（由DDB1和DDB2组成的异源二聚体）协助。虽然已知UV-DDB能特异性识别CPD并通过泛素化将损伤"移交"给XPC-RAD23B，但两者如何协同搜索损伤的分子机制尚不清楚。

为了解决这一科学问题，蔚山国立科学技术大学等机构的研究人员结合单分子DNA curtain技术和生化分析，系统研究了UV-DDB与XPC-RAD23B在DNA上的相互作用。研究发现XPC-RAD23B能显著增强UV-DDB与DNA的结合，并首次证明两者可形成稳定复合物(UX-complex)共同结合CPD位点。更重要的是，研究颠覆了传统认知，发现野生型UV-DDB不仅通过三维碰撞(3D collision)直接结合CPD，还能通过一维扩散(1D diffusion)沿DNA滑动搜索损伤。这些发现为理解GG-NER中损伤识别机制提供了全新视角，相关成果发表在《Nucleic Acids Research》。

研究主要采用了以下关键技术：1) 单分子DNA curtain技术实时观察蛋白-DNA相互作用；2) 电泳迁移率实验(EMSA)定量分析蛋白-DNA结合亲和力；3) 表面等离子共振(SPR)检测蛋白-蛋白相互作用；4) 荧光漂白恢复(FRAP)分析细胞内蛋白动态；5) 免疫共沉淀验证复合物形成。

【XPC-RAD23B增强UV-DDB与DNA结合】
通过EMSA定量分析发现，XPC-RAD23B对未损伤DNA的结合亲和力(K_d
~9 nM)高于UV-DDB(K_d
~26 nM)，但对CPD的识别特异性较差。加入亚化学计量比的XPC-RAD23B(2 nM)可使UV-DDB对CPD的结合亲和力提高2.5倍。单分子成像显示，0.4 nM XPC-RAD23B能使0.2 nM UV-DDB的DNA结合增加5.5倍，且结合主要富集在CPD位点。

【UV-DDB和XPC-RAD23B可共结合CPD】
高浓度XPC-RAD23B(15 nM)条件下，EMSA出现新条带，Western blot证实为UV-DDB和XPC-RAD23B共结合CPD形成的三元复合物。有趣的是，UV-DDB不能反向增强XPC-RAD23B的DNA结合，显示协同作用的单向性。

【UX复合体形成机制】
顺序结合实验表明，先与DNA结合的XPC-RAD23B能有效招募UV-DDB，反之则效果有限。免疫共沉淀和SPR证实两者能在无DNA时直接相互作用，形成稳定复合物。FRAP分析显示在正常细胞内，XPC的存在使UV-DDB迁移率降低，但在UV照射后这种差异消失，说明生理条件下UX复合体可能广泛存在。

【UV-DDB通过1D扩散搜索损伤】
双端固定DNA curtain实验首次捕捉到野生型UV-DDB沿DNA的1D扩散行为，扩散系数约0.025 μm²
/s，符合滑动(sliding)机制而非跳跃(hopping)。在CPD位点，19%的UV-DDB直接结合，81%通过扩散识别，停留时间长达575±131秒。XPC-RAD23B的加入使直接结合比例降至11%，但扩散系数不变，提示UX复合体可能保留UV-DDB的扩散特性。

【研究结论与意义】
该研究提出了"并发招募"(concurrent recruitment)的新模型：在生理条件下，UV-DDB和XPC-RAD23B可预先形成UX复合体，其中XPC-RAD23B通过高亲和力将复合体锚定在DNA上，UV-DDB则负责特异性识别CPD。这种协同作用既增加了UV-DDB在DNA上的负载量，又通过1D扩散提高了搜索效率。研究还发现两者能共结合CPD，为后续泛素化介导的损伤转移创造了条件。

这一发现革新了对GG-NER启动机制的理解，特别是在CPD修复这一长期难题上提供了分子解释。UX复合体的发现为开发增强DNA修复能力的药物提供了新靶点，对预防紫外线相关皮肤癌具有潜在应用价值。研究建立的单分子分析平台也为其他DNA修复蛋白的功能研究提供了范例。