基于无酶熵驱动电路与非凝胶筛分毛细管电泳的多重miRNA高灵敏特异性检测新策略

针对多重miRNA检测中存在的技术瓶颈，南京大学团队开发了一种结合无酶熵驱动电路（EDC）扩增、磁珠纯化和拖曳标签的非凝胶筛分毛细管电泳（NGCE-LEDIF）新方法。该策略实现了7种miRNA的单管同步检测，检测限低至154.6 amol-933.8 amol，回收率88.36%-115.14%，可区分单碱基错配，为肿瘤早期诊断提供了高性价比解决方案。

　　

在生命科学领域，microRNA（miRNA）作为基因表达的精细调控者，其异常表达与癌症等疾病的发生发展密切相关。然而，这些长度仅约22个核苷酸的小分子却给检测技术带来巨大挑战——高度同源的家族序列、极低的丰度、复杂的样本背景，使得传统方法如Northern blot耗时费力，qRT-PCR受限于荧光通道数量，测序技术则成本高昂。更关键的是，疾病发生往往伴随多个miRNA的协同变化，但现有技术难以实现高效、低成本的多重检测。

南京大学的研究团队在《Analytica Chimica Acta》发表的研究中，创新性地将无酶熵驱动电路（Entropy-Driven Circuit, EDC）扩增技术与非凝胶筛分毛细管电泳（Non-Gel Sieving Capillary Electrophoresis, NGCE）相结合，构建了一套名为EDC-NGCE-LEDIF的检测系统。该系统通过引入拖曳标签（drag tags）和磁珠纯化技术，成功实现了7种肿瘤相关miRNA（包括miRNA-21、miRNA-155等）的单管同步检测，检测灵敏度达到阿摩尔级别，且能精准区分单碱基差异。这项研究为临床肿瘤早期诊断提供了兼具高特异性、低成本及高通量的新工具。

关键技术方法
研究采用三种核心技术：1）EDC扩增——利用miRNA触发熵驱动的链置换反应，无需酶参与即可实现信号指数级放大；2）磁珠纯化——通过生物素-链霉亲和素系统高效去除未反应的探针；3）NGCE分离——在毛细管中通过不同长度胸腺嘧啶（T）尾拖曳标签实现7种扩增产物的基线分离。实验选用人血清样本验证临床适用性。

研究结果

背景
研究指出，现有miRNA检测技术面临三大瓶颈：多重检测能力不足、交叉反应干扰、依赖昂贵标记酶。特别是毛细管电泳虽具分离优势，但相似尺寸的EDC产物难以区分，且未反应探针会干扰定量。

结果
通过设计含不同T尾长度（15-45 nt）的EDC底物探针，团队使7种miRNA产物迁移时间差异达0.5-2分钟。磁珠纯化效率>95%，彻底消除探针干扰。检测限最低达154.6 amol（miRNA-27a），血清加标回收率88.36%-115.14%，RSD<10%。实验证实该方法可区分let-7家族单碱基变异，且无交叉反应。

意义
该策略突破传统CE检测通量限制，通过调节T尾长度理论上可扩展至10种以上miRNA。相比需荧光标记或锁核酸（LNA）修饰的方法，成本降低60%以上。其高特异性源于EDC的toehold介导的链置换机制，为临床样本中低丰度miRNA检测提供新范式。

结论与展望
研究成功构建了首个将EDC扩增、磁珠纯化与拖曳标签CE分离整合的多重miRNA检测平台。其创新性体现在：1）T尾作为内源性拖曳标签替代昂贵肽链；2）磁珠分离替代不稳定的SSB蛋白；3）全流程无酶参与提升稳定性。未来通过优化T尾组合，可进一步拓展检测通量，在肿瘤液体活检等领域具有重大应用潜力。

（注：全文数据及术语均源自原文，包括EDC反应条件10 mM Tris-HCl缓冲液、Mg²⁺
浓度12.5 mM等细节，作者Yunlong Sun等声明无利益冲突）