糖基化代谢调控网络构建：GAP-MS技术揭示糖依赖蛋白互作图谱

（推荐语）本研究创新性开发糖基化依赖亲和纯化质谱（GAP-MS）平台，通过小分子代谢调控（如3-F-Sia、Kif）构建五种糖型表型（S/Undec/F/FS/HM），系统解析BSG、EGFR等四种糖蛋白的156种互作中131种糖依赖关系，填补糖型特异性互作网络研究空白，为糖科学及靶向治疗提供新范式。

　　

糖基化代谢控制网络的构建与应用

研究背景与技术创新

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）是理解生命过程的核心，但膜蛋白糖基化的复杂性长期阻碍相关研究。传统方法如糖基化位点突变（如N268Q）仅能模拟完全去糖基化状态，无法反映生理性糖型变化（如高甘露糖HM型或唾液酸化S型）。本研究突破性整合代谢调控与质谱技术，开发糖基化依赖亲和纯化质谱（GAP-MS）平台，通过小分子糖修饰剂（3-氟唾液酸、Kifunensine等）在HCT116细胞中精准构建五种糖表型，实现糖蛋白互作网络的动态解析。

糖表型系统的建立与验证

利用HCT116细胞天然的岩藻糖合成缺陷（GMDS突变），通过外源添加岩藻糖（Fuc）或抑制剂3-F-Sia，成功诱导出唾液酸化（S）、无修饰（Undec）、岩藻糖化（F）、唾液酸-岩藻糖化（FS）及高甘露糖（HM）五种糖型。质谱糖组学分析显示：

• 天然HCT116以S型为主（>90%唾液酸化）
• 3-F-Sia处理使Undec型占比超55%
• Kif处理诱导HM型达95%以上
  糖蛋白质组学进一步证实四种诱饵蛋白（BSG、EGFR、CD44、SLC3A2）的糖型特异性修饰，如SLC3A2在Kif处理后Man9糖型占比显著升高。

糖依赖互作网络的发现

通过数据非依赖采集（DIA）定量质谱与SAINT分析（阈值0.90），从四种诱饵蛋白中鉴定156个高置信互作，其中：

• 66个为新发现互作（未见于STRING/BioGRID数据库）
• 131个（84%）显示糖依赖性
• 糖蛋白互作占比达30%（vs膜蛋白组12%）
  典型案例如EGFR-ARF4在Undec型中互作增强，而BSG-LGALS3因HM型缺乏半乳糖结合基序而显著减弱，印证了糖型对直接/间接互作的调控。

糖型特异性调控模式

拓扑评分（TopS）分析揭示互作网络呈现六类调控模式：

1. HM增强型：如BSG-CDCP1互作
2. Fuc敏感型：CD44-ITGB1在F型中激活
3. 唾液酸依赖型：EGFR-GRB2在S/FS型中富集
   值得注意的是，同一猎物蛋白（如ARF4）与不同诱饵（BSG vs EGFR）可能分属不同调控集群，提示糖型影响具有蛋白特异性。

与传统方法的对比优势

与糖基化位点突变法相比，GAP-MS揭示更接近生理状态的调控机制：

• N268Q突变使BSG-LGALS3互作完全消失
• GAP-MS显示HM型仅部分抑制该互作
  AlphaFold2结构模拟表明，完全去糖基化导致BSG构象剧变（RMSD 10.108 ?），而HM型可能通过局部糖链变化微调互作。

应用前景与科学价值

该技术为糖科学领域带来三大突破：

1. 动态解析：首次实现多糖型平行比较，揭示唾液酸与岩藻糖的协同/拮抗效应
2. 治疗靶点：发现EGFR-ARF4在Undec型中的互作增强可能成为EGFR活性调控新靶点
3. 平台扩展性：可耦合邻近标记（如BioID）或交联技术，进一步解析糖-蛋白直接互作

（注：全文数据已公开于glycointeractome.org数据库）