固态核磁共振间接15 N检测技术揭示真菌细胞壁几丁质的分子拓扑结构

为解决真菌细胞壁中几丁质(15 N标记)在复杂多糖基质中的特异性检测难题，研究人员通过固态核磁共振(MAS NMR)技术，创新性采用NC、NCC、CNC和CNCC多步极化转移策略，在11 kHz魔角旋转频率下实现了全细胞样本中间接15 N检测。该研究成功解析了烟曲霉细胞壁中几丁质的13 C-15 N自旋网络拓扑，为复杂氮多糖研究提供了新方法学范式。

　　

在微生物与宿主的博弈中，真菌细胞壁作为第一道防线，其核心组分几丁质的分子结构直接影响病原体毒力和药物敏感性。然而，传统化学提取法会破坏几丁质的天然构象，而常规¹³
C检测固态核磁共振(ssNMR)在复杂多糖体系中面临信号重叠的瓶颈。更棘手的是，几丁质作为地球上含量第二的生物聚合物，其不溶性特性使得常规溶液NMR难以施展拳脚。这些技术壁垒严重阻碍了抗真菌药物靶点的开发，特别是在烟曲霉等致命病原体耐药性日益严峻的背景下。

法国研究人员在《Solid State Nuclear Magnetic Resonance》发表的研究中，另辟蹊径地利用几丁质特有的乙酰氨基团，将蛋白质研究中成熟的间接¹⁵
N检测策略创新性应用于多糖体系。通过系统比较几丁质与氨基酸的¹³
C-¹⁵
N自旋拓扑相似性，团队设计出NC、NCC、CNC和CNCC四种极化转移路径，在600 MHz谱仪和11 kHz魔角旋转(MAS)条件下，首次实现了全细胞样本中几丁质的高特异性检测。

研究采用¹³
C,¹⁵
N双标记的烟曲霉菌丝体作为生物样本，通过魔角旋转固态核磁共振技术，重点优化了SPECIFIC-CP（选择性交叉极化）的接触时间（3 ms）和DREAM（双量子相干转移）的载波频率。关键技术包括：1）频率选择性¹⁵
N-¹³
C极化转移；2）宽带/选择性同核¹³
C-¹³
C转移；3）多步异核相关实验设计。

3.1 自旋拓扑基础解析
通过对比几丁质单体N-乙酰葡糖胺与蛋白质氨基酸的¹³
C-¹⁵
N网络（图1），发现C₂
-N-C'（55-120-175 ppm）的化学位移拓扑与蛋白质主链高度相似。这种结构同源性为移植蛋白质NMR方法学奠定了基础。

3.2 NC特异性检测突破
SPECIFIC-CP实验（图2）通过精确控制¹³
C载波频率（55.7或177 ppm），分别实现¹⁵
N→C₂
和¹⁵
N→C'的选择性极化转移，信噪比较传统CP提升3倍。磁化强度曲线显示最佳接触时间为3 ms，与蛋白质体系相当。

3.3 NCC级联转移验证
引入PDSD（质子驱动自旋扩散）混合期后（图3），成功捕获C₂
-C₁
/C₃
（55→105/75 ppm）和C'-CH₃
（175→23 ppm）相关信号。值得注意的是，DREAM方案（图4）在55 ppm载波时优先传递C₂
-C₃
负信号，展现了化学位移选择性优势。

3.4 CNC反向探测创新
通过反转SPECIFIC-CP顺序（图5），C₂
-N-C'和C'-N-C₂
实验分别获得175 ppm和55 ppm单峰，证实双向极化转移可行性。这种"分子倒带"策略为复杂多糖序列分析开辟新途径。

3.5 CNCC多维解析
四级转移实验（图6）采用C'-N-C₂
-C₁
路径，DREAM阶段（95 ppm载波）成功捕获105 ppm处C₁
负峰，首次实现几丁质糖环C'至C₁
的完整关联。

这项研究的意义不仅在于建立了首个全细胞几丁质NMR检测方案，更开创性地拓展了固态NMR在非蛋白生物大分子中的应用边界。通过巧妙借鉴蛋白质NMR方法学，研究人员将SPECIFIC-CP的"频率剪刀"与DREAM的"选择性镊子"相结合，成功解开了多糖研究的戈耳狄之结。该技术框架可直接推广至细菌肽聚糖和真菌壳聚糖研究，为耐药菌细胞壁合成机制解析、新型抗真菌靶点发现提供了不可替代的研究工具。特别是在当前临床面临烟曲霉多重耐药威胁的背景下，这种无需化学提取的原位检测技术，有望加速靶向细胞壁药物的开发进程。