大肠杆菌RelB抗毒素C端结构域在RelE毒素抑制与转录阻遏中的关键作用机制解析

为解决细菌II型毒素-抗毒素(TA)系统中结构高度同源但功能特异性调控的分子机制问题，研究人员通过系统解析大肠杆菌RelB-RelE系统中C端截短突变体的功能效应，发现RelB的α3螺旋及L4环对维持RelE高亲和力结合及DNA阻遏活性至关重要。该研究揭示了TA系统调控的多样性，为理解细菌应激响应提供了新视角。

　　

在细菌生存策略中，毒素-抗毒素（Toxin-Antitoxin, TA）系统如同精密的分子开关，能在环境压力下调控细胞生长。其中II型TA系统通过抗毒素直接抑制毒素活性的机制备受关注，但一个核心谜题始终未解：为何结构高度相似的TA系统（如大肠杆菌的RelB-RelE与DinJ-YafQ）展现出截然不同的调控特性？特别是RelB抗毒素如何通过其C端结构域实现RelE毒素的特异性抑制，同时协调DNA转录阻遏功能，这一机制长期缺乏系统阐释。

为破解这一难题，研究人员聚焦RelB抗毒素的C端关键区域，通过构建系列截短突变体（RelBΔ70-79和RelBΔ66-79），结合生长实验、定量结合分析和转录报告系统，首次揭示RelB的α3螺旋及连接环L4是维持RelE抑制的核心元件。研究发现，不同于DinJ仅需9个C端残基即可完全抑制YafQ，RelB需要更长的C端片段（特别是L4环）才能有效中和RelE毒性。光谱位移实验显示，删除L4环使RelB-RelE结合亲和力骤降9000倍（EC₅₀从2.6 nM升至24 μM），导致细菌生长严重受损。

研究采用多技术联用策略：通过细菌生长曲线和斑点稀释实验评估毒素抑制效率；利用荧光标记光谱位移技术定量蛋白互作强度；构建β-半乳糖苷酶报告系统检测relO操纵子的转录阻遏水平；结合AlphaFold 3预测TA复合物与DNA的相互作用构象；通过TEV蛋白酶切割实验验证RelB关键环区的可及性。

关键结果包括：

1. RelB C端是抑制RelE毒性的必要条件：删除α3后的RelBΔ66-79完全丧失中和能力，而仅去除末端β链的RelBΔ70-79仍保留部分功能，表明L4环对稳定α3-毒素互作至关重要。
2. RelB α3和L4环介导高亲和力RelE结合：定量分析揭示RelBΔ70-79与RelE结合强度降低338倍，而RelBΔ66-79突变体结合能力几乎丧失，证实L4环是维持纳米级亲和力的关键。
3. RelE结合RelB是relO最优转录阻遏所需：RelBΔ66-79导致relO位点的阻遏效率下降74%，RT-qPCR显示lacZ报告基因表达增加2倍，证明毒素-抗毒素复合物形成对DNA调控至关重要。
4. RelB环L3和L4具有体内蛋白酶可及性：TEV蛋白酶切割实验显示，L3/L4位点的修饰会激活RelE毒性，暗示这些区域可能是细胞蛋白酶（如Lon）的潜在作用靶点。
5. DinJ-YafQ与RelB-RelE的DNA结合模式差异：AlphaFold预测显示，RelB-RelE结合relO时会发生显著构象变化，而DinJ-YafQ保持刚性结构，这可能解释二者在条件协同性调控中的不同表现。

这项发表于《Journal of Biological Chemistry》的研究具有双重突破意义：在机制层面，阐明了RelB C端通过"结构域分段控制"策略实现毒素抑制与DNA阻遏的双重功能，其α3-L4模块如同分子扳手，精确调节RelE的活性开关；在进化层面，揭示了结构同源TA系统（如RelB-RelE与DinJ-YafQ）通过局部构象差异实现功能分化的规律。这些发现不仅为理解细菌应激响应的精准调控提供了新范式，也为针对TA系统的抗菌药物设计（如模拟RelB-L4的小分子抑制剂）提供了理论依据。尤其值得注意的是，研究提出的"环区可及性激活"模型，为解释环境压力下TA系统快速响应的分子机制开辟了新思路。