可逆性小分子643943靶向XIAP:CASP7-p19复合物选择性诱导CASP3/DR恶性肿瘤细胞凋亡的机制研究

针对caspase-3下调(CASP3/DR)导致的肿瘤化疗耐药难题，台湾研究团队通过多模式虚拟筛选策略，首次发现可逆性XIAP:CASP7蛋白互作抑制剂643943。该化合物通过特异性结合CASP7的Asp93位点，选择性激活CASP7-p19/p12并下调β-catenin/ABC转运蛋白通路，在体外和体内实验中均显示出对三阴性乳腺癌等CASP3/DR恶性肿瘤的特异性杀伤作用，为克服化疗耐药提供了新靶点策略。

　　

在肿瘤治疗领域，caspase-3(CASP3)作为细胞凋亡的关键执行者，其表达下调(CASP3/DR)已成为临床化疗耐药的重要机制。据统计，约60%的乳腺癌患者肿瘤组织存在CASP3表达缺失，导致对顺铂、阿霉素等化疗药物敏感性显著降低。更棘手的是，这类恶性肿瘤往往通过上调caspase-7(CASP7)表达来维持细胞稳态，但新产生的CASP7又会被X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)通过蛋白互作(PPI)形成XIAP:CASP7复合物而失活。这种"代偿-抑制"的恶性循环，使得传统靶向CASP3的促凋亡药物在CASP3/DR肿瘤中收效甚微。

为破解这一治疗困境，台湾研究团队在《Cell Death and Disease》发表了突破性研究成果。研究人员创新性地将XIAP:CASP7复合物确立为药物靶点，通过计算机辅助药物设计发现首个可逆性小分子抑制剂643943。该化合物通过独特的双模式作用机制：既稳定游离态CASP7构象，又破坏XIAP linker-BIR2结构域与CASP7的相互作用，从而特异性激活CASP7-p19/p12而不影响正常细胞的CASP3通路。

研究团队采用多学科交叉的研究策略，主要技术方法包括：1)基于GEMDOCK的多模式虚拟筛选结合位点-基团图谱分析；2)表面等离子共振(BIAcore)测定化合物-蛋白结合动力学；3)免疫共沉淀验证XIAP:CASP7复合物解离；4)建立MCF-7等CASP3/DR乳腺癌细胞模型及小鼠移植瘤模型进行药效评价；5)流式细胞术和TUNEL法检测细胞凋亡。

研究结果部分，首先在"采用多模式筛选策略鉴定可逆性XIAP:CASP7 PPI抑制剂"中，团队通过叠加XIAP结合/游离两种状态的CASP7晶体结构(PDB 1I51和1K86)，发现Cys246位于18?外的变构位点。基于此设计的双模式虚拟筛选策略，成功鉴定出核心结合位点包含D93/H1、Q243/H2两个氢键锚点和C246/V1、A96/V2两个疏水锚点。化合物643943的羟基与Asp93形成关键氢键，其骨架氮原子与Gln243主链相互作用，PLP打分显示其与两种构象CASP7均具有高亲和力。

在"643943破坏XIAP:CASP7复合物并诱导CASP7介导的凋亡"部分，免疫共沉淀显示20μM 643943处理4小时即可显著减少MCF-7细胞中XIAP:CASP7复合物，但对MCF-10A正常细胞的XIAP:CASP3无影响。MTT实验测得EC₅₀为8.48±0.06μM，流式检测显示其诱导sub-G₀期细胞积累，且凋亡效应可被CASP7特异性抑制剂MPS阻断。shRNA敲低CASP7后，643943的促凋亡作用显著减弱，证实其作用依赖于CASP7激活。

"643943结合CASP7并使其从复合物解离"的实验通过GST pull-down证明该化合物能剂量依赖性地破坏GST-XIAP与CASP7的结合。荧光光谱显示7μM CASP7与643943结合后，346nm处荧光强度降低而420nm处增强，计算得K_d=3.1μM，与细胞实验EC₅₀吻合。BIAcore竞争实验进一步证实，含羟基的643943可剂量依赖抑制GST-linker-BIR2与CASP7结合，而去羟基类似物119则无此作用。

关于"计算机模拟揭示可逆性PPI抑制剂的变构机制"，研究显示稳定表达CASP7_D93L突变的MCF-7细胞对643943敏感性显著降低。晶体结构分析发现，643943通过占据Asp93破坏S239-D93氢键网络，进而影响XIAP linker区D148与CASP7 W240的关键相互作用。这种"变构传递"效应解释了小分子如何通过远端结合位点破坏大分子PPI界面。

在"643943对XIAP:CASP7高积累乳腺癌细胞系的选择性杀伤及体内抗肿瘤活性"部分，Western blot筛选发现MCF-7、BT-483、MDA-MB-468等CASP3/DR细胞中XIAP:CASP7复合物水平与643943敏感性正相关。小鼠实验显示20mg/kg剂量下无毒性，且能显著抑制MCF-7和MDA-MB-468移植瘤生长，TUNEL检测证实其促进肿瘤细胞凋亡。

最后在"643943增强化疗药物疗效并克服CASP3/DR癌细胞耐药性"中，研究发现643943与STS或阿霉素联用可协同诱导MCF-7细胞PARP1剪切。在紫杉醇耐药株7TR中，该化合物通过下调β-catenin及其调控的ABCG1/ABCG2等转运蛋白表达，恢复化疗敏感性。CASP7抑制剂MPS可逆转这一效应，证实该通路依赖CASP7激活。

这项研究具有多重重要意义：首先，首次证实XIAP:CASP7可作为CASP3/DR肿瘤的特异性靶点，通过结构生物学指导的变构抑制剂设计，突破了传统PPI抑制剂开发的瓶颈；其次，643943作为首个可逆性XIAP:CASP7抑制剂，在保持CASP3正常细胞活性的同时，选择性激活CASP7-p19/p12，为克服化疗耐药提供了新思路；最后，发现该化合物通过调控β-catenin/ABC转运蛋白通路逆转多药耐药，为联合化疗提供了理论依据。该成果不仅为CASP3/DR恶性肿瘤的精准治疗开辟了新途径，也为开发靶向蛋白互作界面的变构药物提供了范式。