基于浊度法改良的透明质酸酶活性测定新策略及其在USP46-NF41标准修订中的应用

针对美国药典(USP)浊度法测定透明质酸酶(HAse)活性存在试剂难获取、方法细节缺失等问题，研究人员通过优化底物浓度、替换牛血清白蛋白(BSA)替代马血清、调整检测波长至400 nm等技术革新，建立了一种高可靠性、可灵活控制反应时间(30 min-1 h)的改良方案。该研究为重组透明质酸(HA)规模化生产中的酶活性质控提供标准化依据，并推动USP46-NF41专论的修订。

　　

透明质酸酶(hyaluronidase, HAse)作为分解透明质酸(hyaluronic acid, HA)的关键酶，其活性测定直接关系到医疗注射制剂和化妆品用HA聚合物的质量控制。当前美国药典USP46-NF41推荐的浊度法存在三大痛点：依赖稀缺的马血清试剂、关键参数如蛋白浓度未标准化、固定30分钟检测窗口缺乏灵活性。这些问题导致不同实验室数据可比性差，尤其当USP标准酶停产后面临方法失效风险。

BioBreyer R&D Ltda团队联合圣保罗研究基金会(FAPESP)支持的研究人员，在《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》发表研究，系统优化了浊度测定体系。通过双波长对比实验发现400 nm检测酸性条件下HA-BSA复合物浊度更灵敏；证实Tris-HCl和Na₂HPO₄会显著抑制酶活，应避免用于酵母培养基和纯化缓冲液；创新性地用易获取的BSA替代马血清，使批间差异从±15%降至±5%。这些改进使方法验证符合ICH指南要求，为重组HAse工业化生产提供了可标准化的质控方案。

关键技术包括：1) 采用BCA法(bicinchoninic acid assay)定量血清蛋白；2) 建立pH3.5醋酸缓冲体系优化浊度形成条件；3) 通过时间梯度实验确定30-60分钟动态检测窗口；4) 使用欧洲药典参比酶(577 IU/mg)进行方法学比对。

【材料与方法】
研究团队选取757 kDa的鸡冠HA钠盐作为底物，对比HS与BSA的蛋白结合效率。通过BCA法测得HS总蛋白浓度为35.2 mg/mL，而30 mg/mL BSA表现出更稳定的浊度曲线。关键发现是：当HA浓度≥0.5 mg/mL时，640 nm处吸光度趋于饱和，而400 nm仍保持线性响应。

【结论】
改良方案成功解决了原USP方法的三大缺陷：1) 试剂可及性：BSA替代HS；2) 方法灵活性：检测时间扩展至1小时；3) 参数明确化：确定最佳底物浓度(0.5-1 mg/mL HA)和酸性环境(pH3.5)。特别指出Na₂HPO₄会使酶活降低23%，这对重组酵母发酵工艺具有重要指导价值。

该研究不仅为USP标准修订提供实验依据，更建立了适用于不同分子量HA(0.4-1.8 MDa)生产的通用检测平台。从产业角度看，方法学改进可降低质控成本约40%，同时满足FDA对生物制品"质量源于设计"(QbD)的要求。未来可进一步探索该方案在肝素酶等其他糖胺聚糖降解酶活性测定中的适用性。