基于TIMS-TOF-PASEF技术的金黄色葡萄球菌全蛋白质组深度解析新策略

本研究针对金黄色葡萄球菌(S. aureus)蛋白质组覆盖不全的技术瓶颈，开发了整合液相-气相(TIMS)分级的简化流程，通过DDA-PASEF/DIA-PASEF技术首次实现85.6%的蛋白质组覆盖率(2,231个蛋白)，并应用于生长时序动态分析，为病原体致病机制研究提供了新工具。

　　

金黄色葡萄球菌作为威胁人类健康的重要病原体，其复杂的蛋白质调控网络一直是微生物学研究的热点。尽管已有大量研究，但传统质谱技术对这类细菌"暗蛋白质组"（dark proteome，即未被检测到的蛋白质）的覆盖率仍不足72%，严重制约了对该病原体适应机制和致病机理的深入理解。这一技术瓶颈主要源于细菌蛋白质组的动态特性——包括翻译后修饰、蛋白质周转以及环境应激响应等因素导致的复杂性。

美国南佛罗里达大学分子生物科学系的Emilee M. Mustor、Jessica Wohlfahrt等研究人员在《Scientific Data》发表创新性研究，通过整合液相色谱分级与气相离子淌度分离技术，在TIMS-TOF质谱平台上建立了平行累积连续碎裂(PASEF)分析新方法。该研究首次实现了金黄色葡萄球菌USA300 LAC菌株85.6%的蛋白质组覆盖（2,231个蛋白质），较既往最高记录提升13.6%。更引人注目的是，单次DIA（数据非依赖采集）分析即可识别80.5%的已知蛋白质组，为病原体蛋白质组学研究树立了新标杆。

关键技术方法包括：1）优化样本制备流程，整合细胞可溶/不可溶组分与分泌蛋白分级策略；2）采用iST肽段分级与离子淌度（0.8-1.25 1/K₀）双重分离技术；3）在timsTOF Pro质谱仪上建立120分钟DDA-PASEF（数据依赖采集）文库构建方案；4）应用90分钟DIA-PASEF进行生长时序（3/6/16小时）动态分析；5）通过FragPipe、DIA-NN等生物信息学工具实现1% FDR（假发现率）严格质量控制。

Comprehensive Capture of the S. aureus Proteome
研究通过双重分级策略显著提升检测深度：液相分级（iST）结合两个离子淌度窗口（0.8-1.05和1.0-1.25 1/K₀）的DDA-PASEF分析，鉴定到37,339个独特肽段，技术重复间蛋白质定量变异系数（CV）中位数仅8.4%。

Technical Validation
DIALib-QC评估显示：+2/+3电荷态肽段保留时间相关性达r²=0.995，y/b离子碎片比例符合预期（60/40%）。开放修饰搜索发现分泌蛋白中甲酰化修饰（2.9% PSM）显著高于胞内组分（1.8%），提示不同细胞区室存在特异性修饰模式。

Differential Expression Profiling
生长时序分析揭示：从对数期（3h）到稳定期（16h）共有1,178个差异蛋白（FDR<0.05），PCA显示明显阶段聚类特征。

通路富集显示稳定期锰离子利用相关蛋白上调（涉及超氧化物歧化酶活性），同时伴随伴侣蛋白（如GroEL）和tRNA加工酶的表达变化，

印证了细菌为抵抗营养胁迫采取的多元应激策略。

该研究通过方法学创新实现了三重突破：首先，将样本处理流程从Michalik等报道的152次质谱进样缩减至12次，大幅提升通量；其次，单次DIA分析即可覆盖94%的文库蛋白，为临床菌株快速分析奠定基础；最后，公开的2,231蛋白数据库（PRIDE: PXD053994）包含CCS（碰撞截面积）参数，支持后续靶向验证。这些进展不仅为金黄色葡萄球菌毒力调控研究提供全新维度，其技术框架更可推广至其他微生物蛋白质组学研究，对耐药菌监测和抗菌靶点开发具有重要价值。