靶向多重耐药革兰阴性菌的抗菌肽优化设计策略：自组装纳米颗粒FWK的发现与机制研究

为解决多重耐药(MDR)革兰阴性菌感染这一全球性难题，中国研究人员通过脂质修饰和氨基酸替换策略，基于WRK肽设计出具有自组装特性的抗菌肽FWK。该肽可形成38 nm纳米颗粒，30分钟内快速杀灭耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(KPC2)，并在36小时内维持抗菌活性。动物实验证实其安全性及显著降低内脏细菌载量的疗效，揭示了正电荷和两亲性对抗菌活性的关键影响，为低毒高效抗菌肽开发提供新思路。

　　

随着抗生素滥用导致的细菌耐药性问题日益严峻，世界卫生组织将耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌和肠杆菌科细菌列为最高威胁等级。传统抗生素联合用药或加大剂量等应对策略，不仅可能引发不良反应，还面临治疗失败风险。在此背景下，具有广谱抗菌特性且不易诱发耐药性的抗菌肽(AMPs)成为研究热点。然而，多数天然抗菌肽存在效力低、稳定性差、半衰期短等缺陷，亟需通过理性设计进行优化。

针对这一挑战，中国的研究团队以两亲性抗菌肽WRK(WRLRWKTRWRLK)为基础，采用脂质修饰（C6-C16烷基链偶联）和氨基酸替换（苯丙氨酸添加及精氨酸/赖氨酸替换）双策略，系统设计了一系列衍生物。通过微孔板稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)，溶血试验评估毒性，最终筛选出能自组装形成38 nm纳米颗粒的肽FWK。该研究创新性发现FWK通过动态平衡的"单体-纳米颗粒"转换机制，在静电作用下靶向细菌脂多糖(LPS)，破坏细胞壁完整性，实现快速持久的杀菌效果。相关成果发表在《Biomedicine》期刊。

研究主要采用固相合成法制备肽序列，通过MALDI-TOF MS和HPLC验证纯度；运用TEM和DLS表征纳米颗粒形态；采用圆二色谱(CD)分析二级结构；通过时间-杀菌曲线和急性腹腔感染小鼠模型评估体内外活性；结合SEM、SYTO9/PI活死染色及NPN/PI荧光探针阐明膜破坏机制。

3.1 肽序列设计
基于WRK肽，分别通过N端烷基化（C6-C16）和苯丙氨酸添加/精氨酸替换设计两组衍生物。氨基酸替换组中FWK(FWKLFRWKTRWRLK)展现出最优抗菌谱。

3.2 抗菌活性
FWK对MDR大肠杆菌、肺炎克雷伯菌KPC2和鲍曼不动杆菌239的MIC值低至4-16 μM，显著优于脂质修饰组（如C16-WRK的MIC>128 μM）。HeliQuest工具计算证实FWK具有最佳的两亲平衡（疏水矩0.71）。

3.3 溶血毒性
脂质修饰导致溶血毒性随碳链延长而加剧（C16-WRK的MHC<16 μM），而FWK在102.4 μM仍无溶血现象，安全性显著提升。

3.4 FWK理化特性
MALDI-TOF MS确认FWK分子量为2049.21 g/mol（纯度98%）。在SDS模拟膜环境中呈现42.5% α-螺旋结构（WRK仅12.7%），自组装临界浓度(CAC)为22.4 μM，Zeta电位+24.3 mV。

3.5 体外活性与稳定性
32 μM FWK能在30分钟内完全杀灭肺炎克雷伯菌KPC2，并维持36小时抑菌效果。在50%血清或150 mM NaCl条件下，MIC波动不超过2倍，IC₅₀达110.6 μM。

3.6 体内安全性
小鼠急性毒性实验显示15 mg/kg剂量下肝肾功能指标正常，30 mg/kg时仅ALT/AST轻微升高，病理切片显示肝细胞轻度水样变性。

3.7 体内疗效
急性腹腔感染模型中，15 mg/kg FWK治疗组肝脏细菌载量较PBS组降低2个数量级（p<0.05），肾脏病理损伤明显减轻，死亡率从33.3%降至16.7%。

3.8 抗菌机制
SEM显示FWK处理30分钟后细菌膜出现凹陷破裂；LPS竞争实验证实其通过静电作用靶向细菌外膜；NPN/PI荧光证实FWK可剂量依赖性增加膜通透性（64 μM时荧光强度提升8倍）。

该研究突破性地揭示：① 抗菌肽活性核心参数排序为正电荷>两亲性>疏水性；② 苯丙氨酸的引入促进自组装纳米颗粒形成，实现"缓释杀菌"效应；③ 精氨酸相比赖氨酸具有更强膜穿透能力，但后者生物相容性更佳。这些发现为设计抗MDR革兰阴性菌的新型肽类药物提供了明确方向，特别是FWK展现的"纳米颗粒-单体"动态平衡机制，为延长抗菌肽半衰期这一行业难题提供了创新解决方案。未来研究可进一步探索FWK与现有抗生素的协同作用，以及针对其他ESKAPE病原体的适用性。