F-box泛素连接酶ZEITLUPE 1通过SCFZTL1介导的泛素化修饰和蛋白降解抑制苹果中咖啡酸-O-甲基转移酶1的盐胁迫耐受性促进作用

本研究揭示了苹果中F-box泛素连接酶MdZTL1通过形成多聚体E3复合物SCFZTL1靶向泛素化降解关键褪黑素合成酶MdCOMT1，从而负调控盐胁迫耐受性的分子机制。研究人员发现MdCOMT1通过增强褪黑素生物合成和ROS清除能力正向调控盐胁迫响应，而MdZTL1通过泛素-蛋白酶体途径（UPS）抑制这一过程。该研究为苹果耐盐分子育种提供了新靶点，并首次阐明了泛素化修饰在苹果盐胁迫响应中的调控作用。

　　

盐胁迫是影响植物生长发育的主要非生物胁迫之一，会导致渗透胁迫、离子毒性和活性氧（ROS）介导的氧化损伤。苹果作为重要经济作物，其产量和品质受盐胁迫严重影响。虽然已知褪黑素能通过清除ROS增强植物耐盐性，但关键合成酶咖啡酸-O-甲基转移酶（COMT）在苹果中的功能及其调控机制尚不清楚。同时，泛素-蛋白酶体系统（UPS）在植物胁迫响应中的作用日益受到关注，但多聚体E3泛素连接酶SCF复合物在苹果耐盐性中的调控机制仍有待阐明。

为解决这些问题，中国的研究团队在《International Journal of Biological Macromolecules》发表研究，通过分子互作、泛素化分析和功能验证等技术，首次鉴定了苹果中MdCOMT1-MdZTL1蛋白模块。研究发现MdCOMT1是褪黑素生物合成的关键酶，能通过增强ROS清除能力正向调控苹果耐盐性。而F-box蛋白MdZTL1通过形成SCF^ZTL1复合物，介导MdCOMT1的泛素化修饰和26S蛋白酶体降解，从而负调控这一过程。该研究不仅首次报道了苹果COMT同源基因的功能，还揭示了泛素化修饰调控苹果耐盐性的新机制，为耐盐苹果品种的分子设计育种提供了理论依据。

研究采用的主要技术包括：酵母双杂交筛选互作蛋白、免疫共沉淀（Co-IP）验证蛋白互作、体外泛素化实验、26S蛋白酶体抑制剂MG132处理、转基因苹果愈伤组织和拟南芥功能验证、褪黑素含量测定（HPLC-MS/MS）以及ROS检测等。

【MdCOMT1响应盐胁迫作为褪黑素合成的关键生物活性酶】
通过qRT-PCR和Western blot发现MdCOMT1在盐胁迫下表达上调，酶活实验证实其具有催化N-乙酰血清素转化为褪黑素的能力。转基因过表达MdCOMT1显著提高苹果愈伤组织和拟南芥的褪黑素含量和耐盐性，表现为ROS积累减少和抗氧化酶活性增强。

【MdZTL1与MdCOMT1互作并介导其泛素化降解】
通过酵母双杂交筛选和Co-IP验证发现F-box蛋白MdZTL1与MdCOMT1特异性结合。体外泛素化实验证明MdZTL1通过形成SCF^ZTL1复合物（含MdSKP1、MdCUL1和MdRBX1）促进MdCOMT1的多聚泛素化。MG132处理实验证实泛素化的MdCOMT1通过26S蛋白酶体途径降解。

【MdZTL1负调控褪黑素合成和盐胁迫耐受性】
遗传分析显示，过表达MdZTL1降低转基因材料的褪黑素含量和耐盐性，而敲除MdZTL1则产生相反表型。双转基因材料（MdCOMT1-OE/MdZTL1-RNAi）表现出最强的耐盐性，证明MdZTL1通过降解MdCOMT1负调控盐胁迫响应。

研究结论表明，MdZTL1-MdCOMT1模块通过泛素化修饰精细调控苹果盐胁迫响应：在正常条件下，MdZTL1维持基础水平的MdCOMT1蛋白；盐胁迫诱导MdCOMT1表达增加，通过提高褪黑素合成增强ROS清除能力；而MdZTL1的反馈抑制防止过度响应。这一发现不仅拓展了对植物E3泛素连接酶功能的认识，还为通过调控SCF^ZTL1-MdCOMT1通路进行耐盐育种提供了新策略。

讨论部分指出，这是首次在苹果中报道COMT参与褪黑素合成和盐胁迫响应，也是首个揭示F-box蛋白通过泛素化修饰调控耐盐性的案例。与拟南芥中多数F-box蛋白正向调控耐盐性不同，MdZTL1的负调控作用体现了物种特异性。未来研究可探索其他E3连接酶是否参与该通路，以及MdCOMT1的转录调控机制。该成果为解析苹果胁迫应答网络和分子设计育种提供了重要理论依据。