DNMT1复合体与半甲基化DNA及双单泛素化PAF15和PCNA的结构重建及其在DNA甲基化维持中的作用机制解析

为解决DNA甲基化模式在细胞分裂中如何精确传递这一关键科学问题，研究人员通过结构生物学方法成功重建了DNMT1与半甲基化DNA(hmDNA)、双单泛素化PAF15(dmUbp15)和PCNA形成的功能复合体。研究利用质谱光散射和负染电镜证实复合体稳定性，并借助AlphaFold3预测其三维结构，揭示了DNMT1在滞后链复制过程中协同DNA聚合酶δ维持甲基化模式的新机制，为表观遗传调控提供了重要结构基础。

　　

在生命的神秘剧本中，DNA甲基化犹如精密的"标点符号"，决定着基因表达的起承转合。作为表观遗传调控的核心机制，甲基化模式在细胞分裂过程中的忠实传递，直接关系到发育、癌症和衰老等重大生物学过程。DNA甲基转移酶1(DNMT1)是这场遗传"记忆"大戏的主角，它能识别母链DNA上的甲基化胞嘧啶(5mCyt)，并在子链对应位置添加相同的甲基标记。然而这个分子机器如何精准定位复制叉？如何协调DNA复制与甲基化这两个看似矛盾的过程？这些谜题长期困扰着科学家。

西班牙的研究团队在《International Journal of Biological Macromolecules》发表的研究给出了重要答案。他们聚焦于DNMT1与增殖细胞核抗原(PCNA)和PCNA相关因子p15(PAF15)形成的超级分子复合体。PCNA作为DNA复制的"分子滑环"，是协调多种复制相关蛋白的指挥中心；而PAF15经过泛素连接酶UHRF1的双单泛素化修饰(dmUbp15)后，可能成为连接DNMT1与复制机器的关键桥梁。这项研究通过创新性地组合质谱光散射、负染电镜和AlphaFold3结构预测等技术，首次解析了这个四元复合体的组装机制和空间构象。

关键技术方法包括：1) 在大肠杆菌中表达并纯化人源DNMT1、PCNA和突变型PAF15蛋白；2) 化学合成半甲基化DNA双链；3) 通过质谱光散射测定复合体分子量；4) 负染电镜观察复合体形貌；5) 运用AlphaFold3预测复合体三维结构。

2.1 复合体重建与负染电镜观察
研究团队成功将DNMT1、hmDNA、dmUbp15和PCNA按化学计量比重组，质谱光散射显示复合体分子量约400kDa，与理论值相符。负染电镜观察到预期大小的颗粒，但冷冻制样导致复合体解离，暗示其动态特性。24?分辨率的单颗粒重构显示整体形状与AlphaFold预测模型一致。

2.2 AlphaFold预测复合体结构
预测模型显示：PCNA三聚体呈环形包绕DNA双链下游，DNMT1的催化结构域(MTase)结合在上游CpG位点。DNMT1的复制靶向序列(RFTS)通过β-折叠与dmUbp15相互作用，同时接触PCNA两个亚基。值得注意的是，DNMT1的PCNA相互作用基序(PIP)位于PCNA环的"正面"，而MTase结构域却位于"背面"，这种独特排布允许DNMT1在滞后链复制时同步甲基化新生DNA。

结构比较揭示构象变化
与游离DNMT1相比，复合体中RFTS从MTase解离，CXXC锌指和自抑制连接环(AIL)发生显著重排。dmUbp15的N端形成β-链插入RFTS的N叶，两个泛素分子分别靠近Lys15和Lys24。这种结合模式与RFTS-dmUbH3晶体结构相似，但p15链走向不同，提示组蛋白H3和PAF15可能采用不同的RFTS激活机制。

讨论与意义
这项研究提出了DNMT1作用机制的"双轨制"模型：通过dmUbH3在染色质组装后维持甲基化，或通过dmUbp15在复制叉直接修饰新生链。AlphaFold模型支持DNMT1与DNA聚合酶δ在PCNA上的"工具带"式协作，即Pol-δ在PCNA正面合成DNA时，DNMT1在背面同步完成甲基化。这种精巧的时空协调解释了甲基化模式的高保真传递。

特别值得注意的是，模型预测PCNA仅通过电荷相互作用"悬浮"在DNA上，与结合Pol-δ时的构象相似，这不同于游离PCNA的倾斜结合模式。这种特性可能使PCNA在维持复制叉前进的同时，为DNMT1提供足够的活动空间。研究还发现DNMT1的PIP基序位于长无序区，可能通过"飞钓"机制实现快速招募，随后被内部功能域取代——这种分级结合策略为理解PCNA如何协调多种酶类活动提供了新视角。

尽管冷冻电镜未能获得高分辨率结构，但这项研究通过多技术联用和前沿计算模拟，首次描绘出DNA复制与甲基化偶联的分子蓝图。这不仅深化了对表观遗传记忆的理解，也为开发靶向DNA甲基化的抗癌药物提供了新思路。未来研究需验证DNMT1与Pol-δ的协同作用，并探索PAF15在引导DNMT1特异性作用于滞后链的分子机制。