肿瘤冷冻切片空间转录组技术比较研究揭示髓母细胞瘤微解剖结构与细胞异质性

本研究针对空间转录组学(ST)技术在肿瘤研究中的应用选择难题，通过比较RNAscope HiPlex、Molecular Cartography、Merscope和Xenium四种成像技术及Visium测序技术对髓母细胞瘤(MBEN)冷冻切片的分析性能，建立了技术评估框架。研究发现自动化成像技术能有效解析MBEN微解剖结构并捕获细胞类型特异性转录组特征，为肿瘤异质性研究提供了方法学指导。

　　

在肿瘤研究领域，理解肿瘤内部异质性和肿瘤微环境的空间组织是攻克癌症治疗难题的关键。传统单细胞RNA测序(scRNA-seq)虽然能解析细胞转录组，却丢失了至关重要的空间信息。近年来，空间转录组学(spatial transcriptomics, ST)技术的快速发展为解决这一难题带来了曙光，但各种技术方法的性能差异使得研究者面临"选择困难症"。德国癌症研究中心的Anne Rademacher团队在《Genome Biology》发表的研究，首次系统比较了四种主流成像技术对儿童脑肿瘤——具有广泛结节性的髓母细胞瘤(medulloblastoma with extensive nodularity, MBEN)冷冻切片的分析效果。

研究采用的技术路线包括：1)使用相同MBEN患者冷冻切片样本平行开展RNAscope HiPlex、Molecular Cartography(MC)、Merscope(MERFISH技术)和Xenium四种成像技术及Visium测序技术的空间转录组分析；2)通过单核RNA测序(snRNA-seq)数据作为参考；3)开发图像再采集和细胞分割优化流程；4)建立灵敏度、特异性和技术性能的量化评估体系。

在"ST of MBEN samples"部分，研究证实所有成像技术都能清晰显示MBEN特征性的结节区(NRXN3表达)和结间区(LAMA2表达)结构，而Visium由于分辨率不足难以区分这两个区域。通过"ST image acquisition and reimaging of slides"部分的系统比较，发现MC系统表现出最优光学分辨率(352±50 nm)，而Xenium和Merscope分辨率相近(约480 nm)。研究还开发了独特的再成像流程，通过旋转盘共聚焦显微镜(SDCM)显著提升了细胞分割精度。

"Image processing and cell segmentation"部分详细比较了不同技术的细胞分割策略。研究发现使用Cellpose算法对SDCM采集的DAPI图像进行核分割，比宽场图像多识别15-30%的细胞核，且转录本分配率提高约10%。研究特别指出Xenium的细胞扩展策略虽然覆盖95%转录本，但在高细胞密度区域会导致人工假象。

"Sensitivity of ST methods"部分通过空间分箱分析显示，成像技术的灵敏度和特征检测数显著优于Visium测序技术。与snRNA-seq相比，成像技术的转录本检出效率估计为33-37%，是Chromium v2化学方法(14-15%)的2.3-2.5倍。值得注意的是，Xenium数据呈现双峰分布，反映组织边缘区域的转录本覆盖度下降。

"Specificity of automated iST methods"部分建立了创新的特异性评估体系。通过背景探针分析和空间自相关计算(Moran's I)，发现MC和Xenium的假发现率(FDR)较低(约0.4%)，而Merscope为5.23%。研究还发现某些基因(如GFI1、LMX1A等)在所有技术中都呈现低表达，可能是真阴性或RNA二级结构导致难以检测。

在"Detection of cell types across platforms"部分，UMAP分析显示所有技术都能识别MBEN主要细胞类型，但各平台对低丰度转录本的检测差异导致某些细胞亚型仅被特定技术捕获。例如MC特异性检测到TULP1阳性细胞，而Xenium独有检测到CD19+B细胞。通过邻域分析，所有技术都成功揭示了MBEN的三个特征性微环境：结节区(星形胶质样和分化神经元样细胞)、结间区(小脑颗粒神经元前体样细胞)和富含间质/血管/免疫细胞的基质区。

"Implementation of additional readouts"部分展示了技术拓展应用：1)MC样本的虚拟H&E染色；2)Xenium后接Comet系统进行CD45/CD20/Ki67多重免疫染色；3)Merscope通过信号放大检测巢蛋白(NES)等低表达基因。这些方法为多组学整合研究提供了范例。

研究结论部分提出了技术选择框架：MC适合小规模验证实验，Merscope支持大面板(960基因)和