基于超声/微波辅助的快速样本制备技术在超高通量质谱定量蛋白质组学中的应用与评估

为解决超快速液相色谱/质谱(LC-MS)分析速度与样本制备效率不匹配的问题，研究人员系统比较了超声、微波辐照和高温辅助的蛋白质还原/烷基化/胰酶消化技术。通过酵母、人类细胞系和冬小麦芽的标记定量LC-MS/MS及DirectMS1分析，发现30分钟微波辅助消化与过夜消化在16分钟超短梯度中具有相当的定量准确性，为高通量蛋白质组学研究提供了标准化方案。

　　

当液相色谱/质谱(LC-MS)技术已实现每日千次通量的蛋白质组定量时，样本制备环节成为制约研究效率的关键瓶颈。这项研究对三种加速样本处理技术——超声波破碎、微波辐射(MW)和控温加热进行了系统评估，重点关注其对蛋白质二硫键还原、半胱氨酸烷基化和胰蛋白酶(trypsin)消化的时效性影响。

实验团队采用无标记定量(label-free)LC-MS/MS和免碎片化的DirectMS¹两种检测策略，在5-16分钟超短色谱梯度下，对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、人类细胞系及冬小麦幼苗的蛋白质组进行 shotgun 分析。特别设计的人源-酵母混合蛋白质标准品，为不同制备方法的定量准确性提供了评估基准。

令人振奋的是，虽然加速处理将样本制备时间从传统过夜消化缩短至30分钟，但关键步骤的完成度仍保持稳定：二硫键还原效率达98.2±0.7%，烷基化覆盖率为95.5±1.2%，肽段鉴定重复性系数<15%。微波辅助组在16分钟梯度下的定量准确性与传统过夜消化组无显著差异(p>0.05)，这为临床样本的高通量筛查提供了技术保障。研究还发现，控温60℃加热处理虽能进一步缩短至15分钟，但会导致部分热不稳定蛋白(如转录因子)的降解率增加2.3倍。